NgAgo波瀾再現—Cell Res發文否定NgAgo基因編輯功能，附論文作者點評

11月11日晚上8點左右，Cell Research雜誌以Letter to Editor形式在線發表了來自南通大學和復旦大學研究人員合作完成的題為「NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish」的論文（下圖），該文結果表明gDNA/NgAgo 系統在斑馬魚中能實現特定基因敲低導致魚眼部發育缺陷，但是不能對靶基因進行基因編輯。（注：文末附有該文通訊作者劉東博士和作者之一復旦大學王永明研究員的介紹和點評）

這篇文章中作者的研究的靶基因名為Fabp11a（Fatty acid binding protein 11a，脂肪酸結合蛋白11a），該基因在參與調解葡萄糖和脂代謝穩態方面具有重要作用，但是在斑馬魚胚胎髮育中該基因的功能未知。對此，作者想知道NgAgo系統是否能在斑馬魚中工作，針對Fabp11a基因設計了兩條5 -磷酸化的ssDNA（下圖1），與優化過的NgAgo-2nlsmRNA一起注射到1細胞期的胚胎中，有趣的是他們觀察到注射過的胚胎中最終約有30%會產生嚴重的眼部發育表型。第一類表型：眼部有一隻相對小一點的眼睛而另一隻顯得十分小；第二類表型：兩隻眼睛融合形成一隻較大的眼睛（見下圖2）。

圖一

圖二

為了證明是否斑馬魚出現的表型是由於Fabp11a基因遺傳突變造成的，作者抽提了正常斑馬魚胚胎和突變斑馬魚胚胎的DNA對靶基因進行PCR擴增，結果測序結果表明靶基因沒有發生任何基因突變，但是通過RT-PCR檢測Fabp11a基因的表達驚奇的發現該基因的表達有顯著敲低（見下圖E）。

為了更清楚的說明問題，作者進一步做了一些實排除了單獨由NgAgo-2nlsmRNA或者gDNA注射到胚胎導致的表型，而且同時注射NgAgo-2nlsmRNA和錯配的gDNA也不會產生表型，這些實驗結果表明gDNA/NgAgo系統有其特異性。另外實驗結果表明gDNA/NgAgo系統靶向敲低Fabp11a基因導致的斑馬魚眼部的表型可以通過注射Fabp11amRNA回復表型（見上圖D）。

為了進一步確認gDNA/NgAgo系統在斑馬魚中敲低基因是一種普遍的現象，作者又test的另外一個基因ta（no tail/ntl or brachyury），結果表明也有大約30%注射過的胚胎出現沒有尾巴的表型（見下圖）。

此前韓春雨NBT文章中表明gDNA/NgAgo系統在人源細胞（37℃）中能夠有效的產生11.2%-41.3% 的indels。Cell Res這篇文章中也在37℃的條件下檢測了斑馬魚中gDNA/NgAgo系統是否能產生indels，結果表明沒有檢測到任何indels發生。有趣的是在正常情況下，斑馬魚胚胎中注射gDNA和酶活突變的NgAgo mRNA也能產生系列表型，當然同樣檢測不到任何indels的發生。為了再進一步確認斑馬魚的表型是由於Fabp11a敲低造成的，作者還做了一些後續的原位雜交實驗，而且還運用CRISPR/Cas9技術敲除Fabp11a基因也能得到相似的表型，當然基因敲除的表型顯然異常劇烈一些，有約10%的胚胎出現眼睛消失的表型。

總的來說，這項研究結果通過使用gDNA/NgAgo系統在斑馬魚中實現了特定基因的敲低，但是沒有檢測到靶基因上任何indels的出現，因為酶活突變的NgAgo也能產生敲低的效果，作者猜測這個系統可能和酶活突變的Cas9：sgRNA系統類似都能在靶基因處抑制基因轉錄。

論文作者簡介

劉東博士

這項工作是由南通大學江蘇省神經再生重點實驗室劉東副教授領銜完成，根據該實驗室官網資料顯示，劉東於2011年從德國馬克斯-德爾布呂克分子醫學中心/柏林自由大學獲得自然科學博士學位，從2012年8月起任南通大學神經再生重點實驗室副教授，2013年起擔任碩士研究生導師，目前是中國解剖學會再生醫學專業委員會委員，江蘇省發育與細胞學會理事，其主要研究方向為：

1、鑒定參與血管新生以及神經系統發育過程中的全新的調控分子。

2、組織再生過程中血管化的過程及調控機制。

3、利用多種遺傳操作技術建立轉基因和基因敲除斑馬魚模型。

4、篩選調控血管內皮細胞和運動神經元行為的天然化合物。

論文另一位合作者是來自復旦大學生命科學學院的王永明研究員，他曾於2015年入選中組部青年千人計劃，主要研究方向是建立高效的CRISPR/Cas9基因編輯技術用於通過建立疾病模型和篩選相關治療藥物等。

獨家評論

劉東博士課題組合影（圖片由劉東博士提供）

文章共同作者之一王永明研究員對該項工作的介紹和點評（微信語音採訪）：這個工作大約在韓春雨NBT文章發表後一個月開始著手的，然後前後大約做了5個月，最初的想法是運用這個新技術在斑馬魚里對自己感興趣的基因實行基因編輯，看看效果怎樣，但是並沒有想到是如今論文報道的這個結果。在斑馬魚里以前主要是用morpholino的手段敲低基因表達，但是這個文章告訴我們gDNA/NgAgo系統也能實現目的基因的敲低並且效率上也有一定優勢，所以這個工作對於在斑馬魚里敲低基因表達還是十分有意義的。

溫州醫科大學谷峰教授（13位實名呼籲對韓春雨啟動調查的學者之一）對該項工作的點評和疑問：

本研究原預期目的是希望能夠在模式生物斑馬魚上利用韓春雨的研究工具（發表在NBT雜誌）來研究一個未知基因功能，具體是試圖利用NgAgo工具去解析Fabp11a基因在斑馬魚發育中作用，但是並沒有獲得類似韓春雨在人類細胞中基因編輯的結果（對應的靶基因序列產生In/del）。但是仍然發現少量斑馬魚有表型，在此基礎上，通過進一步研究發現，NgAgo/5 p-gDNA系統可能具有基因表達調節的功能，也就是NgAgo/5 p-gDNA通過knock-down去調節Fabp11a基因的功能。該結果在其他基因中得到驗證。

這個研究蠻新穎的，但是仍然有幾個相關問題可能需要去回答:

1. NgAgo加了核定位信號（NLS），是否一定需要在細胞核中發揮作用？如果把核定位信號去掉，是否也能夠發揮作用？是否一定需要5 磷酸化的單鏈DNA（5 p-gDNA），非磷酸化也會有一樣的knock-down效果嗎？雙鏈DNA效果如何？

2. 利用Fabp11a對應的mRNA進行補償實驗，是否有劑量依賴關係？而NgAgo/5 p-gDNA是否能夠作用Fabp11a對應的mRNA？

3. NgAgo/5 p-gDNA似乎顯示比翻譯抑制工具 Morpholino（斑馬魚研究基因功能的一個工具）對基因的knock-down更有效，這個系統是否在哺乳動物細胞也一樣好用呢？

4. 這個研究提示，NgAgo/5 p-gDNA可能是在轉錄水平起作用的，是否是直接與DNA結合起作用的？北京大學孫育傑教授利用圖像工具研究，發現NgAgo/5 p-gDNA無法結合在靶基因對應的基因組位置（網路上有的），似乎與本研究的提示不一致。

美國克利夫蘭醫學中心從事基因轉錄調控研究某博後點評：作者認為是一種類似於dCas9的抑制作用。但是首先作者沒有顯示NgAgo有直接結合到染色體DNA上的能力。而且dCas9是要和KRAB 融合表達以後才能抑制基因轉錄，dCas9 本身對基因轉錄抑制作用比較有限。這樣需要sgRNA的target 位點在TSS附近，這篇文章的2個guide RNA離轉錄位點有點太遠了。不太可能是通過這種機制。其實做一個pol2 ChIP就知道是否是通過抑制了基因轉錄。

丹麥奧胡斯大學博後蔡宇伽博士點評：

雙十一，劉東研究組在Cell Research發表了一篇非常吸引眼球的NgAgo文章。他們在斑馬魚中觀察到了類似RNA干擾的現象，而非此前廣受爭議的基因敲除。這個現象其實是在意料之中，因為此前，諸多小組在重複韓春雨NgAgo的文章的時候，普遍反應可以觀察到gfp基因表達下調。斑馬魚適宜的生活溫度是28.5度左右，在此溫度下作者沒有觀察到基因敲除。由於NgAgo的活性可能跟溫度有關，為此，作者特意把斑馬魚胚胎放置37度，儘管此時作者依然可以觀察到基因表達下調的現象，但是還是沒有觀察到基因敲除。NgAgo介導的基因表達下調機理現在還不清楚。有可能在轉錄階段，但也有可能是在蛋白翻譯階段。如果NgAgo通過與DNA結合干擾基因表達，那麼即使它不直接切割DNA也可以開發出一些有意思的工具，包括熒光定位及與FokI結合定點切割DNA。

BioArt點評：這篇文章的所有工作都是在斑馬魚中做的，而不是直接重複韓春雨NBT論文中的工作，實驗結果清楚的表明gDNA/NgAgo系統能在體內特異性的一致靶基因的表達，但是不能對基因進行切割，這篇文章雖然沒有在論文中直接表明是支持了還是否定了韓春雨的工作，但是實驗結果清楚的告訴我們gDNA/NgAgo系統至少在斑馬魚中不能夠實行基因編輯，間接的否定了NBT的結果。事實上這個結果並不奇怪，其實最早北大魏文勝教授實驗室的結果也表明gDNA/NgAgo系統在293T細胞中能敲低目的基因而不能實現基因切割，筆者還詢問過曾經在小鼠胚胎中注射gDNA/NgAgo的資深研究人員，他也表示在小鼠胚胎中也有類似的敲低現象發生。所以總的來說，這篇論文的報道並不代表韓春雨老師NBT的工作被證實了，後續可能還需要相關的工作去進一步解釋說明，特別是解釋RNAi的機制是什麼，或許結構生物學能給出一些答案。

（致謝：感謝Cell Research編輯汪劼博士及時提供的信息，感謝論文通訊作者劉東博士和論文共同作者之一王永明研究員對該項研究工作的介紹和點評，感謝谷峰教授百忙之中對這項研究的點評，感謝蔡宇伽博士的點評，感謝華東師範大學李大力教授對本文的審閱，感謝BioArt顧問委員會的成員提出的寶貴意見。）

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