更准、更快、更低耗：顯微新技術瞄準活細胞「小世界」

知識 12-01

?SDOM的原理示意圖

編者按：

10月31日，Nature Methods雜誌的「研究亮點」欄目報道了由北京大學席鵬課題組及其合作者提出的一種新的基於偏振偶極子方位角的超分辨技術SDOM^[1]。這一技術不僅為超分辨提供了一種全新的熒光偶極子的維度、提升了解析度，能夠更清晰地認識其標記的蛋白結構，還為本領域近期的一個熱點爭論提供了解答。

北京大學博士生張昊、清華大學博士生陳龍為共同第一作者，北京大學席鵬教授、澳大利亞悉尼技術大學金大勇教授及清華大學清華信息國家實驗室張奇偉課題組的高軍濤副研究員為共同通訊作者。

撰文 | 呂浩然

責編 | 李曉明

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從「顯微」到「顯納」

隨著顯微技術的發展，人們觀察事物的尺度已經可以深入到微米，甚至是納米級別。

然而，顯微技術本身也有天花板。德國物理學家恩斯特·阿貝曾指出：光學顯微鏡解析度的極限，大約是可見光波長的一半，最小約為200納米（阿貝衍射極限）。

不僅如此，顯微技術本身的發展局限也會影響到其它學科。北京大學工學院教授席鵬告訴《知識分子》，比如，生物學家更樂於追求在微觀層面了解生命的奧秘，「解析度決定了細胞的研究深度」。

據席鵬介紹，顯微鏡主要分為光學顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。電子顯微鏡雖然解析度可以做到很高，但低溫、真空等實驗環境往往會影響實驗對象的生物活性。因此，科學家們一直在不斷努力，試圖尋找突破光學顯微鏡分辨極限的方法。

在尋求突破的過程中，諾獎得主Eric Betzig於1995年在論文中提出了「從不同維度將熒光分子區分開來，從而實現超分辨」的想法論^[2] 。這一思想與現實中三維空間觀察（超分辨）及對應二維投影（傳統成像）類似。

在進行顯微觀察時，人們為了確定單點的位置，會從不同維度對一個點進行描述，最簡單的方法就是坐標法：在三維空間確定三個坐標軸，然後用三個維度（x,y,z）進行描述。而Betzig教授則添加了第四個維度——時間，將空間上重疊的點分離，從而更加細緻的描述一個點的位置。隨後，Betzig教授提出了單分子定位超分辨技術PALM，這一技術通過在時間維度將分子分開，從而實現了超分辨^[3] 。

然而，雖然PALM的空間解析度可達10-20納米，卻由於該技術需要將粒子在時間上拆分，直接造成時間維度的犧牲，因此其成像時間比較長（典型在十幾分鐘量級）。

?Betzig提出的超分辨思想：從另一維度對熒光分子進行分離，從而達到超分辨。

偏振：超分辨顯微的新「四維」

此次席鵬課題組則在三維坐標的基礎上引入了第四個新的維度——熒光偏振。

熒光的偏振特性（Fluorescence Polarization）的發現要早於超分辨概念，1926年就被Jean Baptiste Perrin（法國物理學家，1926年諾貝爾獎獲得者）等人發現。然而在熒光超分辨顯微中，對於熒光的其他特性如熒光強度、激發與吸收光譜、熒光壽命等方面，皆存在很好的應用，但人們卻對熒光偶極子的方向（偏振）卻甚少關注。

雖然之前有科學家在偏振方向做出了一定的嘗試，但所獲成果卻在該領域引起了一定的爭議和質疑。

2014年，Peter J. Walla課題組在Nature Methods上發表文章，通過對激光進行偏振調製來實現稀疏重構的超分辨成像^[4] 。而在今年年初，同樣在Nature Methods上，Jan Keller課題組則對此提出了質疑，並發表了針對這一文章的評論^[5] ：利用熒光偏振不能夠獲得進一步的超分辨。Walla課題組一方面承認了Keller等人的觀察，另一方面則用新的實驗捍衛他們自己的工作^[6] ，從而引出了一個有意思的爭論：偏振調製能否為超分辨帶來更多信息？

由於Walla課題組和Keller課題組都是從傳統的熒光強度來看待這一問題，席鵬課題組及其合作者則從偏振方向提出了一種名為SDOM（Super-resolution Dipole Orientation Mapping）的新型超分辨技術，該技術引入熒光的偶極子角度作為熒光分子的第四維度，同時從熒光強度和熒光各向異性來考慮偏振調製能否帶來更多超分辨信息，完美地回答了這一爭論^[7] 。

?Nature Methods 2016年1月就「偏振調製是否對超分辨有幫助」這一問題展開了爭論。

據席鵬介紹，傳統的熒光各向異性顯微成像技術往往只能觀察簡單樣本的熒光偏振，而對於複雜樣本，熒光的偏振由於阿貝衍射極限的存在會受到眾多熒光團的影響，從而只能觀察到平均效果。而超分辨偶極子方向映射（SDOM）技術則實現了同時觀察熒光的強度和偏振，從偏振調製數據中將空間強度信息和偏振信息解調出來，既提升了成像的空間解析度，也提升了探測熒光團偶極子方向的精度。

「一方面，我們通過在傳統熒光顯微鏡的外部加上一個偏振片，使入射的激發光產生偏振；另一方面，我們聯合合作者編製相應的演算法對被觀察物體的偏振進行分析解調，從而獲得超分辨的效果，相較於之前的成像效果，SDOM可以將解析度提升到50-60納米，尺度縮小了一個數量級，在解析度上有了很大的提升」席鵬提到。

?相較於之前的「一片模糊」（圖片中左上角），SDOM技術提供的成像（右下部分）更加精準、清晰。

同時，席鵬還表示，SDOM技術具有很快的成像速度（最快可達每秒5幀超分辨），對激發光功率要求也很低（毫瓦量級），非常適用於活細胞觀察。

在具體操作方面，作者將SDOM技術應用在固定細胞（海馬神經元的SDOM成像以及哺乳動物細胞的肌動蛋白成像）以及活體酵母細胞中的septin蛋白成像。目前，關於基因組三維結構的研究正在掀起一輪新的熱潮，而NPC（核孔複合體）對於染色體在細胞核內的定位及基因組的三維結構非常重要。因此，作者也利用該新技術對NPC進行了偏振超分辨成像。這些圖像都預示著SDOM超分辨技術在生命科學領域中巨大的應用前景。

值得一題的是，本工作的演算法已經通過Github開源，目的是讓更多的科研工作者能夠從中受益。

? 2014年諾貝爾化學獎頒給了在超分辨領域做出傑出貢獻的（從左至右）埃里克?白茲格、施泰方?海爾和威廉姆?莫納爾（圖片來源：Nobelprize.org）

最後，席鵬表示，從上世紀九十年代中期到現在，每過十年左右，顯微技術就會達到一個節點，「從94、95年超分辨概念被提出，到05、06年超分辨迎來了一個爆髮式的增長，各種技術頻出；再到2014年，諾貝爾化學獎頒給了超分辨領域的三位開創者，各成果也在很多領域得到了應用。但由於過去大多數超分辨技術強烈依賴於染料，這也限制了它們的應用範圍。而SDOM技術由於不依賴於特定的熒光染料，因此有望在生物顯微中得到進一步的應用。」

目前，國際上正在掀起一系列偏振超分辨的熱潮。超分辨的諾貝爾獎得主William E. Moerner（美國化學家，2014年諾貝爾獎得主）利用熒光分子偏振研究了DNA的構象變化^[7]；法國科學家Sophie Brasselet等人提出了PolarSTORM技術，結合熒光單分子定位和偏振信息對DNA和肌動蛋白進行了超分辨成像^[9]；美國布朗大學Tani課題組則對DNA和F-actin（纖維形肌動蛋白）的偏振進行了動態跟蹤^[10] 。

參考文獻

1.Strack, R., Orientation mapping in super-resolution. Nature Methods, 2016. 13: p. 902.

2.Betzig, E., Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters, 1995. 20(3): p. 237-239.

3.Betzig, E., et al., Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science, 2006. 313(5793): p. 1642-1645.

4.Hafi, N., et al., Fluorescence nanoscopy by polarization modulation and polarization angle narrowing. Nature Methods, 2014. 11(5): p. 579-584.

5.Frahm, L. and J. Keller, Polarization modulation adds little additional information to super-resolution fluorescence microscopy. Nature methods, 2016. 13(1): p. 7-8.

6.Hafi, N., et al., Reply to "Polarization modulation adds little additional information to super-resolution fluorescence microscopy". Nature methods, 2016. 13(1): p. 8-9.

7.Zhanghao, K., et al., Super-resolution with dipole orientation mapping. Light: Science & Applications, 2016. 5: p. e16166.

8.Backer, A.S., M. Lee, and W. Moerner, Enhanced DNA Imaging Using Super-Resolution Microscopy and Simultaneous Single-Molecule Orientation Measurements. Optica, 2016. 3(6): p. 659-666.

9.Cruz, C.A.V., et al., Quantitative nanoscale imaging of orientational order in biological filaments by polarized superresolution microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2016. 113(7): p. E820-E828.

10.Mehta, S.B., et al., Dissection of molecular assembly dynamics by tracking orientation and position of single molecules in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2016. 113(42): p. E6352-E6361.