「人源化小鼠」在腫瘤免疫療法中，有哪番作為？

11月25日，初冬乍寒，生物探索「BioShare」分享交友會再一次在大家的期待中如約舉辦。秉承之前6期的「著眼醫藥創新、分享前沿技術」的主題，第七期活動以「依賴於人源化小鼠的腫瘤免疫療法臨床前評價方法介紹」為焦點，針對當下最熱門的腫瘤免疫療法，對其中關鍵的臨床前評價方法展開論述和探討。

主題報告：2位「一線大咖」的技術分享

孫瑞林博士：基因工程人源化小鼠模型的製備及在腫瘤免疫治療中的應用

第一位演講嘉賓是來自於上海南方模式生物科技股份有限公司的模型研發部經理孫瑞林博士。孫博士在過去5年間，帶領團隊完成了1200餘種基因修飾小鼠模型的製備，在小鼠基因修飾技術、小鼠基因調控研究方面具有豐富的經驗。

報告之初，孫博士深入淺出地介紹了腫瘤免疫治療的現狀。他表示，腫瘤免疫治療在近幾年取得了飛速發展，已經成為治療腫瘤的第四代常規治療方法。該領域包括腫瘤疫苗、非特異型細胞因子治療、細胞治療以及免疫檢查點抑制劑4個大方面。

其中，免疫檢查點抑制劑是腫瘤治療和新葯研發的有力主角，包括PD-1、PD-L1和CTLA4等在內的檢查點抑制劑都展現出卓越的持久應答能力。它們以「剎車」機制啟動免疫系統靶向腫瘤細胞。但是，正因為這類療法的作用原理是基於免疫系統，所以在常規腫瘤療法的研發及評價平台上無法進行驗證，這意味著我們需要構建一套迅速準確、系統有效的腫瘤免疫療法臨床前評價方法。

孫博士強調，臨床前，免疫治療藥物的評估模型需要滿足3個條件：具備正常的免疫系統；能夠成瘤；能夠表達人類免疫檢查點分子。

那麼，如何構建人源化小鼠模型？孫博士介紹說有兩種方法。第一種是將人造血幹細胞移植到免疫缺陷小鼠體內，使其重建人類免疫系統。第二種是構建轉基因小鼠，使其表達人類基因。其中，基因工程小鼠製備過程中，首先需要考慮試驗目的，涉及怎樣的腫瘤模型，它意味著不同的小鼠背景需求。

緊接著，孫博士詳細介紹了幾種人源化策略，包括插入人源基因至小鼠基因ATG位點、替換整個外顯子、人鼠共存等等，並對這些方法各自的利弊進行了細緻分析。目前，孫博士團隊已經針對PD-1、PD-L1和CTLA4等分子構建了人源化小鼠，並成功用於抗體藥物篩選、藥效評估和腫瘤治療。

最後，孫博士還講解了基因工程小鼠定製的方法，包括傳統胚胎幹細胞（ESC）打靶和人工核酸酶（Talen、Cas9）介導的基因修飾方法，基於這類方法可以針對不同的小鼠模型進行特定的基因編輯。

彭思穎博士：人源化小鼠模型在腫瘤免疫治療評價中的應用

第二位嘉賓是北京艾德摩生物技術有限公司的聯合創始人兼首席執行官彭思穎博士。如何基於動物模型評價腫瘤免疫治療？這是彭博士報告的主線。她著重圍繞「人源化免疫重建小鼠在腫瘤免疫療法評價的應用」進行了分享。

患者來源的腫瘤異種移植PDX模型（patient derived xenograft model）是一種體內模型，主要是將病人的新鮮腫瘤組織簡單處理後移植到免疫缺陷小鼠上，依靠小鼠提供的環境生長，保留原代腫瘤微環境和基本特性。彭博士強調，實際上鑒於腫瘤異質性以及本身就很複雜的特點，動物模型構建過程中會遇到很多問題，涉及3個主要因素：腫瘤組織、細胞的提取、腫瘤微環境因素（免疫組織和間質細胞）和免疫系統。

隨後，彭博士帶大家回顧了免疫缺陷型小鼠的發展歷程，從無胸腺裸鼠（T細胞功能缺陷）、T細胞和B細胞聯合免疫缺陷小鼠（SCID或者Rag1/2）到多聯免疫缺陷型小鼠（T細胞、B細胞和Nk細胞功能缺陷，NOG或者NSG）。她強調，動物模型的選擇和重建對後續試驗的開展至關重要。

如何在免疫缺陷型動物上將人的系統更多地參與，使其跟患者的臨床表現更為接近？這就需要免疫系統更完善的人源化小鼠模型。彭博士表示，可以將造血幹細胞（HSCs）移植到免疫缺陷小鼠體內，使其重建人免疫系統。在此基礎上移植人源腫瘤組織，獲得腫瘤免疫雙人源化小鼠模型（Ideal-Immune Model）。

Hu-CD34 NSG小鼠模型構建流程圖

這一模型能夠真實模擬人免疫系統與腫瘤相互作用的過程，可用於臨床前評價腫瘤免疫療法的有效性和安全性以及放化療、靶向藥物的評價，例如免疫檢查點抑制劑、CAR-T療法、溶瘤病毒、腫瘤疫苗等等。

對於CAR-T療法，彭博士表示：「從我們這邊的研究評價結果來看，我對CAR-T的臨床治療應用很有信心。腫瘤異質性是腫瘤治療中存在的最大障礙，每個腫瘤都有各自不同的一些靶點，腫瘤的靶點治療特異性很強，消滅一個靶點，又會有新的靶點，而找出每個腫瘤的靶點難度係數很高。目前對於解決腫瘤靶點的問題，我認為採用混合靶（多靶點）是首選，現在已經有很多藥物是針對多靶點的；其次是藥物的聯合使用，例如PD-1可以和化療葯等進行聯合使用。」

CAR-T在急性血液腫瘤的臨床試驗中已經取得了顯著的療效，被認為是最有前景的腫瘤治療方式之一。近期，它開始被用於實體瘤的臨床試驗。彭博士建議，在CAR-T療法進入臨床之前，使用人源性腫瘤組織異種移植（PDX）小鼠模型作為腫瘤患者的替身進行相關驗證，因為PDX模型高度保持了腫瘤組織的異質性、分化程度、形態特徵以及分子特性。

除了藥效評價，CAR-T療法還需要注意安全性問題。彭博士解釋說：「藉助腫瘤移植小鼠模型，通過監測小鼠體重變化、腫瘤生長情況、CAR-T細胞分布、細胞因子濃度等指標，可以評估其安全性。」

圍爐對話：實踐、探索中，我們遇到了哪些問題？

當乾貨滿滿的報告結束之後，現場的生物探索會員們圍繞模型製備、藥效評估等實際操作過程遇到的技術問題與嘉賓進行了「零距離」的交流互動。

考慮到篇幅有限，小編挑選了其中一些代表性問題，「重現」嘉賓們精彩的答疑解惑過程。（PS：想知道更多的內容，歡迎大家光臨BioShare之後的活動現場哦。）

Q：如何增加PDX小鼠模型的成瘤率？

嘉賓：鑒於PDX模型的異質性相對較強，所以可以多傳代培養，使其成瘤趨向穩定。此外，還可以將人源腫瘤組織處理成細小的塊狀，類似於單細胞的狀態。

Q：Hu-NSG模型構建過程中，CD34+細胞以及人源化腫瘤組織移植的時間點如何把控？

嘉賓：CD34+細胞一定是先移植，因為人免疫系統在小鼠體內重建大約需要12—16周的時間，之後再移植腫瘤組織。只有免疫細胞充分浸潤到腫瘤組織中才能用於藥效評價。具體的時間把控應該依據試驗需求而設定。

Q：選擇多大的小鼠用於腫瘤免疫人源化模型構建？

嘉賓：造血幹細胞移植之前需要對小鼠進行處理，使其本身的造血幹細胞清除乾淨。我們選擇新生2天的小鼠，直接通過靜脈注射造血幹細胞，它不需要進行前期處理，但是操作要求較高。

Q：雙人源化小鼠模型如何驗證，例如PD-1/CTLA4？

嘉賓：理論上，雙人源化的策略與單人源化一樣。我們可以通過PD-1和CTLA4分子的體內表達情況進行驗證，並不是從藥效結果上對模型進行評價。

活動最後，二位同時表示，人源化免疫重建小鼠可以成為推進新葯研發的有力工具，從而加速國內創新藥物和新型療法的誕生。他們對腫瘤免疫療法表達了極大的肯定，並認為它是唯一有望徹底攻克癌症的療法，有望填補手術、放化療所不能企及的空白。

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