如何優雅快速地完成Western Blot

這段時間在私信區和評論區收到希望看到有關western blot方面文章的信息。說老實話，該話題的文章已有很多，不少試劑公司也推出了相關手冊、指南，因此本司機無意再重複一遍。不過有些私藏貨還是可以拿出來分享的。

想起以前讀書的時候，覺得做western blot簡直就是一件麻煩的事，準備功夫一大堆，配製試劑和洗洗涮涮的時間幾乎佔了一半。萬一遇到個坑爹抗體，時間精力就全白費了。近幾年在新的單位工作，由於配套和管理更加完善，加上摸出了些門道，漸漸覺得western blot也沒那麼討厭了，甚至做起來還挺舒服。按照本文的方案，從收蛋白開始，到最後曝光出條帶，完全可以在朝九晚五的一天時間內搞定。下面就讓我們一起來看看這個方案的設計思路。

首先我們把整個western blot實驗流程過一遍：1、收蛋白；2、蛋白定量；3、電泳；4、轉印；5、封閉；6、孵育一抗；7、孵育二抗；8、曝光。

1、收蛋白：

這個環節，其實並沒有多少優化的空間。裂解/勻漿、離心這兩個步驟必不可少，因此我們不需要在這上面花心思。

2、蛋白定量：

為了節省時間，我們可以在收蛋白的離心步驟，開始配製蛋白定量試劑。一般常用BCA法和Bradford法。BCA法反應時間長，大概需要30 min，但線性範圍寬。Bradford法只需反應5 min即可測定，但線性範圍窄。如果預計樣品組之間的蛋白濃度差異較小，可以選用Bradford，否則最好選用BCA較為妥當。（當然，如果樣品中存在去污劑、還原劑或高濃度脂類等雜質，就要根據需求選取相應的測定方法。）

3、電泳：

前面兩個步驟，省時間的程度基本跟在擠什麼一樣有限，但從電泳這個步驟開始，便是重頭戲。首先，你可以選用預製膠。這不光節省了大量配膠、等膠凝的時間，還保證了PAGE膠質量的一致性（我相信絕大部分搬磚的都試過，明明就沒做錯什麼，但膠就是死活不凝……更別說某天出門忘了洗臉，膠就漏了一大截的噁心事……）。

我們實驗室常用NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels，1.5 mm，10-well或15-well。梯度膠覆蓋分子量的範圍大，配合MES或者MOPS的緩衝液，可以分辨不同分子量範圍的條帶。Bio-rad、Sigma-aldrich等公司，均有出售預製膠。

此外，多數預製膠可在較高的電壓中電泳（如200 V），如此一小時內即可完成。

（PS：肯定有人說，不是土豪用不起預製膠什麼的。其實現在預製膠也不算貴了，而且由於沒有多少生產上的技術門檻，如果進口的用不起，還有許多國產貨可以用。大量採購之前仔細測試一遍便是了。此外，做銷售的朋友曾經告訴過我，價格都是談下來的，那些標價從來都是虛的。）

4、轉印：

如果你現在使用的是半干轉，那麼恭喜你，可以放心繼續用。如果你還在使用濕轉的話，不妨試試半干轉。當我還是小白司機的時候，也是迷信濕轉。誠然，濕轉有它的優點，那就是有利於高分子量蛋白的轉印。但實際上，根據個人經驗，接近200 KDa的蛋白（如EGFR），使用半干轉的效果也不錯。而根據同事的說法，像mTOR這種直逼300 KDa的蛋白，只要優化半干轉的條件，也照樣能做出結果（如按照儀器內置的程序設定轉印一次，暫停冷卻一段時間，再轉印一段時間）。

目前我們實驗室目前使用的是Bio-rad的Trans-Blot Turbo，通常低電流或電壓轉印30 min，即可將150 KDa以下的蛋白徹底轉印。更高分子量的也能轉印過去，但大約還有10%或更低的殘餘（可以延長到35 min）。求快的話，10 min已可轉印大部分蛋白。

相比起動輒一兩小時的濕轉，使用半干轉可以節省大量的時間，還省得配一大堆液體試劑。

5-7、封閉→一抗→二抗：

這幾個環節就合并在一起解說吧。如果你不趕時間，可以慢悠悠地按照封閉一小時後一抗4℃過夜、等第二天再繼續的方案。而這一天剩餘的時間，你可以拿來上上B站、刷刷知乎之類的……（要不然我以前的狀態寫「利用上班時間刷知乎的搬磚狗」是怎麼來的）

但如果你想一天內（即下班時間之前）做完全部步驟，請參考下面這個方法：

用3% BSA室溫封閉30 min；用1% BSA配製一抗，室溫孵育30 min；洗膜4×1~3 min（每次時間延長一點點，第一次甚至隨便晃幾下就行）；用1% BSA配製二抗，室溫孵育20 min；同法洗膜後即可曝光。

為了縮短孵育一抗二抗的時間，多數實驗方案會建議室溫孵育1小時。然而這很容易直接導致加班。經本人親測，可以適當降低封閉液以及抗體稀釋液中的蛋白濃度，進一步縮短反應時間。

當然，降低了BSA的濃度，帶來一個負面影響便是提高非特異結合的幾率。所以，抗體質量是至關重要的因素。那如何找到一個好的抗體呢？這裡安利兩個網站：

1）CiteAbhttps://www.citeab.com/

CiteAb號稱是世界最大的抗體搜索引擎，其特色是搜索結果可根據抗體被引用的次數來排序。引用越多的產品，質量往往越有保障。

如果你的蛋白樣品來自於人類，那麼恭喜你，可以使用The Human Protein Atlas這個網站。雖然說這個網站的本職功能是人類蛋白質組學的資料庫，但其中提供了部分抗體測試數據，包括western blot驗證。

此外，還有一個網站http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/，主要是提供組蛋白抗體的驗證數據。

但是，並不是所有抗體都能這麼給力。同時，抗原的表達水平也決定能否使用快速方案。總之，只能靠自己嘗試，並記錄好條件和結果，方便自己，也方便實驗室的其他小夥伴。

8、曝光：

不知道到了現在，還有多少人選擇在暗房裡面壓片曝光呢？儘管傳統膠片的圖像解析度極高，但化學發光成像儀出來的圖片質量完全滿足發表需求，更節省了實驗以及後期處理的時間。此外，諸如Bio-rad ChemiDoc XRS+這種檔次的儀器，其動態範圍和線性均由於膠片。

而依然在使用膠片的小夥伴，不妨試試我從別處聽來的省事經驗：把6張膠片疊在一起同時壓片，然後出去愉快玩耍半小時左右（視發光液靈敏度、二抗稀釋比例等條件調整）再回來洗片。據說，信號最強的條帶也難以將最後一片膠片過曝，弱的條帶經過長時間曝光也有較高的幾率做出來。總之，在這6張片中總能找到合適的曝光，這樣就不用一直在暗房裡面泡著了。（PS：本司機未親測，我剛接觸western blot時就在用成像儀了）

最後再附上幾點優雅高效工作的心得：

1、作息規律，吃飯、睡覺、起床都應準點，切忌晚點。適量運動有助於維持充沛精力和體力。

2、除實驗記錄本外，再準備一冊日程本，按順序、分條目寫上每一天要完成的實驗及其他待辦事項，並在完成的條目前打鉤。（打鉤，而不要劃掉，有助於將來查閱。）

3、準時到達實驗室後，第一件事請先打開實驗本和日程本，開始計劃日程，設計實驗，然後開工。

4、在做第3點的同時，絕對不要泡茶、泡咖啡，絕對不要摸電腦，絕對不要碰手機上的各路IM、社交等軟體，除非不做這些就無法開展實驗。總之集中所有精力先把實驗做完，寫好實驗記錄（重要！），再來處理案頭工作。（否則你會發現，屁股一沾椅子就起不來了，然後一晃就十點了，再糾結一下就該吃中飯了，然後半天的時間過去了，然後屁事都沒幹，然後你就畢不了業了……）

5、先想好，再動手。在實驗室中，時間除了浪費在發獃之外，還有很大一部分浪費在白做的實驗上。而這就是新手的通病。因此在做實驗之前，要先想好：我要回答什麼科學問題？這個科學問題為什麼很重要？這個科學問題是否具有原創性？我需要設計什麼實驗去回答這個問題？每一個實驗分別回答了問題的哪個方面？做完這些實驗是否充分回答了這個問題？這個實驗對回答這個問題是否有幫助？簡而言之，Work smart，再是work hard。千萬不要把自己搞得貌似很忙，貌似做了很多實驗，其實什麼問題都沒有解決，白白浪費了時間和精力，順路還會把自己搞得很沮喪。

Western blot做不出來？該祭一下蛋白大神了