華東師大李大力組等首次在小鼠和斑馬魚中實現可穩定遺傳的遺傳密碼子擴充——附獨家專訪和點評

BioArt按：12月9日，Cell Research在線發表了來自華東師範大學上海市調控生物學重點實驗室與巴黎第六大學巴黎索邦生物研究所、加州大學舊金山分校藥學院、法蘭西公學院生物跨學科研究中心、悉尼大學醫學院、華東師範大學腦功能基因組學研究所和巴黎高等師範學院生物系等多家國內外單位合作的題為「Heritable expansion of the genetic code in mouse and zebrafish」最新研究成果，這項研究主要是利用轉基因技術等手段在世界上首次構建了具備遺傳密碼子擴充能力的轉基因小鼠和斑馬魚。該文通訊作者分別是華東師範大學上海市調控生物學重點實驗室李大力博士、加州大學舊金山分校藥學院王磊博士和巴黎第六大學巴黎索邦生物研究所葉世欣博士，華東師範大學生命科學學院2014級博士研究生陳宇庭為論文第一作者，華東師範大學為論文第一作者單位。

論文詳解：

生物體內編碼20種天然氨基酸的三聯體密碼子通常是64個，其中含3個終止密碼（UAA,UAG,UGA）一般只作為終止信號，不編碼氨基酸。但是人們發現在極少數古生菌和真菌中能利用終止密碼子，將硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸等稀有氨基酸整合到蛋白質中，這種情況也被認為是遺傳密碼子的天然擴充。科學家們希望利用這一現象來建立操控蛋白質的技術手段，這樣能更精準、更靈活地在離體和體內探究蛋白質結構與功能的關係、翻譯後修飾對蛋白質生理功能的影響，甚至精確調控蛋白質活性。通過多年的努力，科學家們最終採用各種化學與合成生物學的手段，將具有特殊官能團的非天然氨基酸(Unnatural amino acids, Uaa)引入到蛋白質中。這些新的蛋白質某些氨基酸殘基帶有與天然氨基酸所不同的全新官能團，賦予它們新的物理化學性質、生物學特性或藥理學性質。

為了使Uaa能夠像天然氨基酸一樣特異地整合到多肽鏈上，本論文通訊作者之一的王磊博士（博後期間在Peter Schultz教授實驗室）2001年首次建立了通過擴充大腸桿菌遺傳密碼子來實現非天然氨基酸定點整合的方法，該成果被發表在當年的Science雜誌上（見下圖）。

這種方法是將編碼Uaa所需的特定翻譯元件引入到大腸桿菌，使其具備利用非天然氨基酸編碼蛋白質的能力。如圖1所示，簡單而言包括僅能識別非天然氨基酸的tRNA（orthogonal tRNA）與氨醯tRNA合成酶(orthogonal synthetase)的正交體系，以及不與編碼氨基酸的內源密碼子競爭而又能被新的tRNA所識別、解碼的「特殊密碼子」（unique codon）（圖1）。

圖1 （來自2009，Qian Wang et al,Chemistry & Biology）

在這個正交體系中，用到的「特殊密碼子」一般是琥珀終止密碼子UAG。 經過十多年的發展，現在已經構建了非常多的Uaa/tRNACUA/氨醯tRNA合成酶（aaRS）正交體系，而這種利用終止密碼子（主要是UAG）編碼Uaa的方法，被稱為遺傳密碼子擴充。該正交系統都是由基因編碼，具備運用到所有的可進行遺傳操作的生物體的潛力。目前該技術除了廣泛應用於體外培養的細胞之中，在擬南芥、非脊椎動物如線蟲，果蠅等物種中都證明其具備穩定遺傳能力，得到了很好的拓展與應用。但是能否在脊椎動物中構建可穩定遺傳的tRNACUA/aaRS正交體系，實現遺傳密碼子擴充仍然未知。在脊椎動物中的嘗試不僅僅是技術上的應用拓展，更為重要的是這是對自然產生的遺傳密碼的改變，在進化上更加高等的脊椎動物是否允許密碼子擴充，能否維持和穩定傳遞？這些都是非常關鍵的重要遺傳學問題。這篇文章率先報道通過遺傳操作方法構建的tRNACUA/AzFRS轉基因小鼠和斑馬魚具備遺傳密碼子擴充能力，而且這些動物沒有表現出明顯的缺陷，證明遺傳密碼子擴充可以在脊椎動物中穩定遺傳將為生物學與醫學研究提供非常有前景的新的技術體系和動物模型。

小鼠作為一種常用的哺乳動物模型，因其與人類具有高度基因同源性，被廣泛應用於發育、生理和病理等研究。作者首先將能編碼非天然氨基酸p-azido-phenylalanine (AzF)的tRNACUA/AzFRS正交對的表達質粒進行優化，並建立RS(tRNA)4×轉基因小鼠品系。接著，作者通過Western Blot檢測了轉基因小鼠各組織AzFRS的表達水平，證明建系成功。通過對轉基因小鼠的組織形態觀察、肝組織RNAseq，血液生化指標檢測，證明了將tRNACUA/AzFRS正交對基因表達元件引入到小鼠體內並未對其造成顯著生理損傷。隨後通過分離小鼠的原代細胞，如神經細胞、免疫細胞和成纖維細胞，利用慢病毒雙熒光報告體系，檢測到tRNACUA/AzFRS正交對在神經細胞和免疫細胞上能夠實現終止密碼子的通讀，但在成纖維細胞中未發現通讀。作者證明可能是由於tRNA 在成纖維細胞中表達受限制而導致通讀不能被觀察到。給轉基因鼠飼餵含有非天然氨基酸AzF的水也沒有發現動物血液生化指標的明顯變化，證明小鼠中可以實現遺傳密碼子的擴充（見下圖）。

為了能夠在活動物中觀察到遺傳密碼子擴充的現象，作者選擇了斑馬魚作為研究對象。斑馬魚與哺乳動物具有許多保守的分子與細胞機制，是活體成像研究的重要模式動物。利用Tol2 轉座子技術將優化後的tRNACUA/aaRS 正交對基因表達元件引入到斑馬魚基因組，構建了可穩定遺傳的RS(tRNA)4×轉基因斑馬魚。在轉基因斑馬魚的胚胎和成體組織中檢測了AzFRS的表達，將該轉基因斑馬魚直接飼養在含有AzF的水中，並未發現AzF對它們有毒性，接著作者利用雙熒光報告質粒，在F2代以後的轉基因斑馬魚活體內觀察到終止密碼子的通讀，實現了斑馬魚的遺傳密碼子擴充（見下圖）。

總之，這篇論文通過將tRNACUA/aaRS 正交對基因表達元件穩定整合到小鼠和斑馬魚基因組內，構建了可遺傳的轉基因小鼠和轉基因斑馬魚率先在原理上證明脊椎動物遺傳密碼子擴增的可行性和遺傳穩定性，說明遺傳密碼子在複雜生物中具有較高的延展性。非天然氨基酸可以攜帶多種官能團，具有特殊理化性質，將來有望實現複雜動物體內的蛋白質分子標記、模擬翻譯後修飾、光控激活特定蛋白質分子等精確操控，成為體內精細、可控的研究蛋白質功能的新手段。 當然，從目前結果來看，脊椎動物體內擴充遺傳密碼子的效率比在單細胞中低，進一步的技術優化將提高Uaa的插入效率和擴充其應用。該課題組今後可以採用多種方法和手段，希望該課題組能實現哺乳動物遺傳密碼子的高效擴增，使其成為更為普適性的技術體系。

專家點評：

陳鵬（北京大學化學與分子工程學院教授，北大-清華生命科學聯合中心PI，中組部青年拔尖人才，國家「傑青」）

華東師大李大力、美國UCSF王磊、法國巴黎第六大學葉世欣等研究人員的該項工作，首次在小鼠和斑馬魚中實現了可穩定遺傳的遺傳密碼子擴充技術（genetic code expansion）。可以說，該工作是在脊椎動物中應用遺傳密碼子擴充技術的開創性工作。通過幾天前北大藥學院周德敏教授發表在Science雜誌的基於該技術的病毒疫苗一文（詳見此前BioArt的深度報道《BioArt深度解讀丨Science報道北大周德敏課題組在病毒疫苗領域的重大突破——附特別點評》），遺傳密碼子擴充技術在生命科學基礎研究及生物醫藥領域的價值可見一斑。

如今，該技術的常規應用大多數還是在大腸桿菌（原核生物）和酵母、哺乳動物細胞（真核生物）等體系中。由於基因操作的便利，研究者們可通過常規的轉染或轉化方法實現非天然氨基酸在這些體系中的定點引入。然而，將遺傳密碼子擴充技術拓展到高等生物中則面臨許多挑戰。迄今為止，雖然研究者們已將該技術應用到了諸如線蟲、果蠅、擬南芥等多細胞體系以及致病菌、病毒等多種病原體當中，但在高等模式生物中的使用還相當困難。

目前來看，在高等動物中引入遺傳密碼子擴充技術有兩個思路，一是從成體動物入手，一個從胚胎入手。這兩個方向的努力都在最近獲得了突破。今年8月，英國劍橋大學和MRC分子生物學實驗室的Jason Chin團隊在Nature Chemical Biology雜誌上發表論文（見下圖），報道了他們在活體小鼠大腦中實現遺傳密碼子擴充技術的工作。該論文利用腺病毒轉染體系，在小鼠腦部引入了tRNA及氨醯tRNA合成酶，成功地在活體小鼠腦部實現了非天然氨基酸的定點引入。該體系不是一個穩定遺傳的系統，也不能在全身均一表達，同時其轉染所使用的病毒採用顱內注射的方法引入成年活體小鼠當中，而非天然氨基酸則通過腦內灌注給葯，在操作上較為複雜。

而此次李大力等人發表工作的重要性，一方面在於其將該翻譯體系引入了高等動物當中，更重要的一方面，在於其具有可穩定遺傳的特性。他們採用從胚胎入手的思路，直接向小鼠的合子中轉入編碼tRNA及氨醯tRNA合成酶的基因，經過胚胎、幼崽階段，篩選出成功引入遺傳密碼子擴充體系的成體小鼠。這些小鼠通過雜交，可在後代中穩定維持一定比例的表達有遺傳密碼子擴充體系的轉基因小鼠。文中一系列數據顯示，該轉基因小鼠的代謝與正常小鼠沒有區別，而在各個組織中，均顯示出一定程度的氨醯tRNA合成酶的表達，在分離出的原代細胞中可進行非天然氨基酸的定點引入。從這點上來說，該工作明確展現了遺傳密碼子擴充技術在脊椎動物中引入、維持、遺傳的能力。綜上，該工作提供了基於遺傳密碼子擴充技術的寶貴的可傳代模式動物，顯著提高了利用該技術在高等動物中進行深度探索的可行性。

當然，在高等動物中實現非天然氨基酸的高效表達還有許多需要優化的方面，該文章是一個開創性的源頭。例如，本文中也提到，該策略得到的轉基因小鼠，其遺傳密碼子擴充元件的表達量具有組織特異性，在一些組織或細胞中因表達量低而無法被檢測到。另外，非天然氨基酸在活體小鼠內直接給葯和表達的可操作性，也是迫切需要優化的問題。隨著這些挑戰性問題的逐漸解決，有望在不遠的將來真正實現非天然氨基酸向活體動物的可控、特異、定點引入，為在活體動物中的蛋白質化學生物學研究奠定基礎！

李大力老師接受BioArt獨家專訪：

BioArt：請問大力老師最初做這個課題的idea來自哪裡？或者說是什麼原因驅使您做這樣一個看起來跟您目前課題組的主要研究方向似乎關聯不大的課題？

李大力：2013年我們建立了小鼠和大鼠的基因編輯技術體系以後，促使我對一些遺傳學新技術比較感興趣，希望能在哺乳動物模型中建立新的技術體系，提高技術的適用性。而讓我接觸到遺傳密碼子擴充這一技術比較偶然，主要得益於我們華東師範大學與法國高師集團聯合培養研究生項目。2014年春節前，在我留法學生的聯繫下認識了本論文通訊作者之一的葉世欣老師。她春節回國探親期間我們見面交流了一下各自的研究方向。世欣利用非天然氨基酸標記技術做出了非常重要的成果。這項技術令我耳目一新也激起了我的興趣，特別是了解到當時還只是在線蟲和果蠅等低等動物中實現了可遺傳的密碼子擴充後更加讓我覺得是一個很好的機會。因為這不僅僅是一個技術問題，更重要的是遺傳學的一個基本問題：高等動物中能否耐受遺傳密碼子的擴增，密碼子擴增後給生物體帶來的後果是什麼？當然，我也希望能在哺乳動物中建立新技術，開展新的基礎和應用研究。當時我就提出跟世欣合作，過完年拿到質粒立即開始了相關工作。在轉基因小鼠構建成功後，我們又與王磊老師取得了聯繫，他對這一課題合作非常感興趣。後續在轉基因小鼠的功能性驗證和論文寫作方面王磊老師都給予了極大的幫助。

BioArt：您這篇文章運用的技術和不久前北大周德敏教授發表的Science文章（詳見BioArt此前的深度報道《BioArt深度解讀丨Science報道北大周德敏課題組在病毒疫苗領域的重大突破——附特別點評》）中用的技術類似，他們把這個技術用於改變現有的病毒疫苗製備技術，那麼您的這項研究將來有哪些應用前景？

李大力：我們所使用的技術與周老師在science上發表的工作是非常類似的，只是具體使用的非天然氨基酸和氨醯tRNA合成酶/tRNA正交對不一樣。當然，周老師的工作是非常震撼的，其意義和應用價值遠大於我們的工作，可以把該技術的應用帶上了一個新的台階。我們的工作的意義主要還是在基礎研究方面，證明脊椎動物可以穩定遺傳擴充的密碼子而且沒有帶來明顯的不良作用。這為將來在高等動物模型中實現蛋白質的標記、蛋白質翻譯後修飾的功能研究以及蛋白質活性的精確調控等方面提供新的解決方案。最想做的是利用光感應的非天然氨基酸在動物體內實現光遺傳學方法精確控制蛋白質活性。當然，暫時而言我們這個體系效率還比較低，這影響了它的適用性。我們後期還在不斷改進，希望能有更高的通讀效率，實現更多應用。

BioArt：我們注意到此前這個系統在線蟲和果蠅中已經建立了穩定的遺傳系統，那麼為何在斑馬魚和哺乳動物裡面卻遲遲沒有建立起來，您的這個工作前後大概花費多少時間去完成？

李大力：我對這個領域的發展也不是特別了解，據我所知還是有幾個課題組在開展類似的工作，只是我不大清楚他們工作進行到哪一步了。至於為何沒有其他課題組發表，我不清楚。當然，要是有人發表了我們就很可能不會開展相關課題了。我猜測可能有幾個方面的原因：在這個領域的幾個主要貢獻者多數都是化學背景，主攻方法學研究，對於高等模式動物系統不是太熟悉，沒有特別花精力去運用陌生的系統來拓展這一方法的應用。另外，也有可能是做了但是沒有成功。其實這個課題遠比我之前設想的要複雜，因為這麼多年來不單是沒有構建穩定遺傳的脊椎動物系統，連穩定表達這一系統的細胞系都是Jason Chin在去年才利用轉座子系統建成。其實當時我也在用轉座子建stable cell line，但是沒有Jason動作快。我們的小鼠中也發現氨醯tRNA合成酶的表達是沒有問題，關鍵是tRNA是否能工作。我們開始檢測了MEF細胞，並沒有發現有明顯的通讀。但是我們並沒有放棄，而是考慮到tRNA表達可能不同組織之間有差異，所以選擇了神經細胞和骨髓間充質幹細胞，恰恰是在這兩種細胞裡面發現了明顯的通讀。所以原因可能是我們的小鼠中轉基因插入的位點比較特殊，外源基因表達相對比較好，而且我們選擇了多種原代細胞進行測試。我們轉基因小鼠中的工作一共用了兩年半的時間完成，而斑馬魚的工作主要是法國的課題組完成的。

BioArt：最後問一個比較confidential的問題，就是您這個工作有著怎樣的投稿經歷，希望您給圈內的讀者朋友分享一下，或者說為何最終選擇了Cell Research這本雜誌發表。

李大力：坦誠的說在投稿cell research之前我們也嘗試過兩個雜誌。後來我們了解到可能會面臨非常強的競爭，所以希望能夠比較順利的把論文儘快發表，畢竟能夠讓讀者儘快看到我們的論文是最重要的。經過多次討論，大家最終一致認為Cell Research是最好的選擇，不僅僅是因為近幾年在國際上影響力已經非常大了，聲譽很好，論文質量高，更重要的是跟編輯溝通可能會更加順暢。所以我先跟雜誌溝通並很快投稿。一審回來之後，3個評審的意見都非常positive，當然也提了一些領域裡面非常感興趣但也很難在技術上實現的問題。其中有評審也說「it would be understandable if the authors argue that such experiments are beyond the scope of the current report」「While not essential for this study」。所以我們又主動跟編輯溝通，補充了技術上可行的一些重要實驗，論文也很快被接受了，可以說這次投稿是一次非常愉快的經歷。

附論文評審人給出的高度評價：

「The work represents a significant technical achievement and will be a major step forward as a tool system to study a variety of biological processes in living model vertebrate organisms, both ex vivo and in vivo.」

「The studies have been well-performed and the findings are very convincing.」

附：論文主要作者簡介：

李大力研究員，2001年畢業於湖南師範大學獲學士學位，2004-2007年在美國德州農工大學開展聯合研究，2007年獲湖南師範大學遺傳學博士學位，同年受聘於華東師範大學生命科學學院從事教學與科研工作, 先後破格晉陞為副教授、研究員。研究方向主要關注基因編輯等遺傳操作新技術的研發與應用。在國際上率先利用CRISPR/Cas9技術構建基因修飾大鼠的技術體系，實現大鼠多基因敲除，極大地提高了基因修飾動物構建效率；利用基因編輯技術通過定點修復凝血因子9基因的突變成功地在成年小鼠模型中治癒B型血友病。近年來以通訊作者身份在國際知名生物學期刊Nature Biotechnology,Nature Protocols，Cell Research,Nucleic Acids Research和EMBO Molecular Medicine等雜誌上發表研究論文20餘篇，申請基因編輯相關發明專利三項，其中一項已獲授權。2016年12月，李大力老師入圍長江學者青年項目（公示名單）。

Lei Wangis an associate professor (tenured ladder-rank faculty) at UCSF. He received BS and MS from Peking University mentored by Zhongfan Liu, and PhD from UC Berkeley mentored byPeter G. Schultz. His graduate research resulted in the first expansion of the genetic code to include unnatural amino acids (Uaas) in 2001, for which he was awarded the Young Scientist Award by the journal Science. After postdoctoral training withRoger Y. Tsien, Wang started his group at the Salk Institute in 2005, and moved to UCSF in 2014. Wang』s group has developed new methods for the expansion of the genetic code in a variety of cells and model organisms, including mammalian cells, stem cells,C. elegans, and recently embryonic mouse. His group discovered that release factor one (RF1) is nonessential inE. coli, and engineered autonomous bacteria capable of incorporating Uaas at multiple sites with high efficiency. By developing the concept of proximity-enabled bioreactivity, Wang』s group designed and demonstrated that a new class of Uaas, the bioreactive Uaas, can be genetically encoded in live systems. These bioreactive Uaas enable novel covalent bonding abilities to be specifically introduced into proteins and biosystems, opening the door for new protein engineering and biological research in vivo. Wang is a 2006Beckman Young Investigator, a 2006 Searle Scholar, and a 2008 National Institutes of Health Director』s New Innovator Award recipient.Wang lab website:https://pharm.ucsf.edu/wang（王磊博士授權發布英文版簡介）

葉世欣，Lehmann, 法國國家健康與醫學研究院終身研究員，課題組組長，1998年本科畢業於北京大學化學系獲得學士學位，2004年獲得賓夕法尼亞大學博士學位，2004-2009年在洛克菲勒大學從事博士後研究，2010-2011在巴黎高等師範學院做博士後研究工作，2011年獲得法國國家健康與醫學研究院終身研究員，繼續受聘於巴黎高等師範學院，2015年受聘於巴黎第六大學巴黎索邦生物研究所計算和定量生物學實驗室(UMR 7238 CNRS)並擔任課題組組長。研究方向主要是1) To apply methods associated with the genetic code expansion to understand the structure-function relationship of proteins. 2) To investigate the possibility of building basic functional proteins with a minimal set of amino acid repertoire.近年來，以第一作者或者通訊作者在Nature，Nature Chemical Biology，PNAS等國際著名雜誌上發表多篇重要研究論文。其中2010年利用光譜學方法研究視紫紅質受體構象變化，被2011年諾貝爾化學獎獲得者Brian Kobilka稱為「是不斷啟發與推動其他課題組在腎上腺素能受體（beta-adrenergic receptor)的研究」。

陳宇庭，論文第一作者，華東師範大學生命科學學院2014級博士研究生，該同學獲得了華東師大研究生出國（境）短期研修項目與計算和定量生物學實驗室共同資助，目前正在巴黎第六大學巴黎索邦生物研究所計算和定量生物學實驗室學習。

（致謝：感謝陳宇庭同學對本文的貢獻，感謝李大力老師在百忙之中接受BioArt專訪，感謝北大陳鵬教授的精彩點評！）

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