從無糖基化抗體Atezolizumab談糖基化修飾重要性

大概幾年前，當筆者剛剛進入生物製藥行業時，無論是工業界還是學術界的共識均是，加起來不到6kDa的糖基化對於抗體的功能起到決定性的作用。這其中，英國伯明翰大學的RoyJefferis教授在多篇高影響因子的期刊或著作上，從溶解性的理化功能，到親和力等生化特性，再到半衰期和免疫原性等臨床指標，數次強調糖基化修飾對抗體功能的重要性，一時間糖基化似乎無所不在，無所不能。可是基於宏觀異質性(Macroheterogeneity: 糖基化的位點)和微觀異質性(Microheterogeneity: 糖基化的組成)的特性，這「糖」卻對開發和生產抗體藥物的工程師們一點也不甜。因為對生產工藝的理解不夠深入，似乎工藝過程中各個參數均會影響到糖基化的指標，糖基化的精確控制要求讓工程師們叫苦不迭；另一方面多變的糖基化結構對做化學分析的科學家們也是巨大的挑戰，好在質譜等技術從另一個維度的快速發展，極大地滿足了人們對糖基化結構的好奇心，即使這樣，目前對於特定糖基化結構的分析仍是生物製藥最大的難點之一。

彼時，被這小小的糖基化折磨得痛苦不堪的我們不禁在想，這糖基化真的可以起到這麼大的作用嗎？開發一個無糖基化的抗體藥物是否可行？可是，工業界卻在加強糖基化功能的道路上越走越遠，越來越多的ADCC和CDC功能加強的藥物被轉化到臨床中。

意外的是，在特定的研究領域中，部分研究者發現，無糖基化的抗體甚至比糖基化版本的抗體功能更令人滿意，因此他們反而對抗體的糖基化修飾進行了敲除。近來Genentech的PD-L1抗體Atezolizumab上市引起了人們極大地關注，不僅僅因為它是首個PD-L1抗體，更因為其無糖基化的結構，一時間糖基化修飾對抗體藥物結構與功能的影響再次成為業界討論的話題。借著Atezolizumab上市的春風，本文筆者和各位一起共同梳理一下糖基化修飾對抗體藥物開發的影響。

一、糖基工程抗體

目前糖基工程抗體大部分以岩藻糖去除為主，以強化糖基化介導的ADCC效應，因此多應用於抗腫瘤方面。天然情況下，CHO細胞表達的抗體90%具有岩藻糖化，通過對表達該抗體的細胞中相關岩藻糖合成酶的敲除，可以使該抗體表達的糖基化的岩藻糖比例降至接近0%。從目前的pipeline來看，和ADC藥物情況類似，去岩藻糖技術由於專利的原因，僅集中於少數葯企手裡。但相信隨著更多如CRISPR等基因編輯技術的誕生，會有更多開源的技術可以供葯企採用開發無岩藻糖化的抗體。後期筆者將單獨帶來無岩藻糖化的抗體開發專題，並帶來國內某葯企無岩藻糖化的產品數據。

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這其中最引人注目的當屬Rituxan的無岩藻糖升級版產品Gazyva。在一項慢性淋巴細胞白血病(CLL)的頭對頭比對的Ⅱ期臨床試驗中，使用Gazyva聯合Chloramubucil相比Rituxan聯合Chloramubucil的完全響應率從65%提高到78%，PFS提高了11.5(26.7 vs 15.2)個月，體現出顯著的臨床顯著性。5月27日，羅氏再次發布了Gazyva針對濾泡性淋巴瘤最新頭對頭臨床試驗結果，顯示與利妥昔單抗+化療相比，Gazyva+化療能夠顯著延長既往未接受過治療的濾泡性淋巴瘤患者的無進展生存期，達到了Ⅲ期臨床試驗Gallium的主要終點。

二、無糖基化抗體

目前無糖基化抗體的產品線比較少，僅有Genentech的Atezolizumab獲得批准，它們的早期產品Onartuzumab與c-Met相關，是第一個在E.coli里表達的全長完整抗體，雖然在技術上實現了飛躍，但臨床價值仍是一個問號。同時，Tolerx算是無糖基化抗體開發中最活躍的公司之一了，目前它們有三個無糖基化抗體在臨床，採用的均是N297A突變技術。這其中與GSK合作開發的靶向CD3的抗體Otelixizumab算是走得最遠的，但是在一項Ⅰ型糖尿病的多中心240位患者的關鍵Ⅲ期臨床試驗DEFEND-1中，Otelixizumab並沒有達到首要終點，所以GSK公司終止了另一項Ⅲ期臨床試驗DEFEND-2，他們將通過分析DEFEND-1的數據後再擇期啟動最新的臨床試驗。Xencor公司也一直廣泛參與無糖基化抗體開發中，2005年左右的時候宣布與Genentech合作開發無糖基化版本的trastuzumab等產品，後面似乎也不了了知了。不過該公司特有的Xmab技術可以特定地改造抗體與FcγRs結合的能力，比如可以選擇性地提高抗體與FcgRII的結合能力。

2.1 構建無糖基化抗體的原因

根據目前臨床階段的藥物管線分布以及相關文獻的報道，構建無糖基化抗體的原因有一下幾點：

2.1.1 降低抗體引起的炎症及細胞毒性

去糖基化的抗體可以有效減少FcγRs和C1q的結合能力，因此所以無糖基化的抗體可以廣泛應用於，僅依靠於受體的阻斷等不需要Fc片段的效應功能的臨床方面，同時顯著減少不良反應和安全性問題。文獻報道去除抗體297位的糖基化位點，可以將於FcγRI的親和力減少100倍，因此可以明顯減少由FcγRI介導的免疫細胞的激活和受體功能。此外，無糖基化的抗體可以進一步減少與與Fc片段親和力較低的FcγRs (FcgRIIa, FcgIIb, and FcgIIIa)以及C1q的結合，因此有效減低ADCC、ADCP和CDC介導的效應功能。這一原因基本上是大多數無糖基化抗體設計的初衷，也確實在臨床階段顯示了一些優勢。

2.1.2 由於去糖基化後的Fc片段更為靈活，因此可以選擇性地和特定的FcγRs結合

去除糖基化後，可以使抗體CH2部分的結構更為靈活，所以可以一定程度上減少與FcγRs結合的空間阻力，因此可以選擇性地與部分FcγRs結合。基於這一特性，可以通過結合氨基酸突變技術，可以調整與FcγRs結合的結合，因此可以平衡Fc片段介導的效應功能。Sazinsky[1]等通過將Fc片斷的部分氨基酸進行隨機突變(見圖)，可以形成一系列對特定FcγR結合能力較強的抗體變體，選擇性地恢復部分糖基化版本抗體的功能。此外，這一技術還可以使工程化的無糖基化蛋白實現原糖基化蛋白不具備的效應功能，轉化成新的臨床優勢。例如Xencor公司的XmAb5871和XmAb7951都是特定提高了抗體與FcgRII的結合能力，比改造前顯示出更有優勢的臨床價值。

2.1.3 簡化原始糖基化抗體的生產工藝，提高工藝穩定性及產物均一性

由於哺乳動物細胞存在易污染、表達量低及培養周期長等的問題，部分研究者為了將其他表達系統(如原核等)應用到抗體藥物生產平台中，所以會大力推進去糖基化的抗體的研究。但筆者認為這基本是在炫技術，即便這些蛋白生產出來了，免疫原性和蛋白摺疊也會存在諸多不確定性。不過在哺乳動物細胞中表達無糖基化的抗體倒確實可以有效提高產品的均一性，減少工藝開發和質量控制的壓力。

2.1.4 糖基化的狀態不會顯著影響pH依賴的FcRns結合

糖基化的狀態不會顯著影響pH依賴的FcRns結合，因此無糖基化的抗體不會其半衰期(3周左右)，這一原因使無糖基化抗體仍然保持有生物大分子的優勢。

2.2 無糖基化抗體對穩定性的影響

無糖基化抗體對結構和功能的穩定性可以從以下幾個方面進行考慮：(1)對蛋白酶的敏感性(2)熱力學穩定性(3)多聚體的形成性(4)pH的穩定性。

在生理條件下，IgG蛋白具有更緊實的球形結構，因此比其他糖蛋白更能耐受蛋白酶的消化。但當去除糖基化修飾後，抗體蛋白對於胰蛋白酶等的敏感性顯著增強。這一變化主要由是糖基化末端修飾消除引起的，比如GlcNAc和Galactose。差示掃描量熱法顯示去除糖修飾後可以引起CH2區域的穩定性改變，降低去摺疊溫度和維持結構穩定的自由能，表明去糖基化的抗體結構靈活性在增強。此外，因為抗體生產純化階段多使用低pH進行捕獲，同時低pH也使用在病毒滅活階段，無糖基化的蛋白在低pH情況下更容易有多聚體形成的趨勢，但通過生產工藝的優化和製劑配方的優化，可以解決相關問題。

三、結語

目前在臨床的無糖基化抗體多為抗炎症方面的，僅依賴受體和配體的阻斷實現抗體功能。從這點上講，鑒於Avastin安全性方面的問題，如果將Avastin的糖基化敲除，是否可以有效減少Avastin的副作用，應該值得期待。

同時，無糖基化抗體的進一步發展，去掉糖基化後通過氨基酸位點的突變使恢復Fc片段介導的效應功能成為可能，同時經過有選擇性的優化與FcRns結合功能，將最大化無糖基化抗體的臨床應用，這也成為未來無糖基化抗體發展的理性方向。因此，如前面談道，單純基於更改表達系統而開發的無糖基化抗體將愈來愈少地走向臨床。所以，無論是糖基化功能增強還是無糖基化均是為了更好的實現抗體功能，也就是說有沒有的關鍵點不在於有沒有糖，而是如何發揮抗體本身具有的功能。所以，未來的無糖基化抗體應該不僅僅以去糖基化入手，還因該結合其他方面的結構來優化功能，「平衡」仍將是一個玄之又玄的話題。

總之，由於目前無糖基化抗體與原始版本的頭對頭對比的數據還比較少，所以無糖基化抗體的臨床價值仍需要更多產品的支持。佛家雲: 「如人飲水，冷暖自知。」這Glycosylation到底對葯企(銷售額)和患者(療效)是苦是甜，也只有等他們「嘗嘗」之後才知道了。

參考文獻：

[1]Sazlnsky SL,OttRG, Silver NW,Tidor b, Ravetch JV,Wittrup KD:Aglycosylated immunoglobulin G1variants productivityly engage activating Fc receptors. Proc Natl Acad Sci USA 2008,105:20167-20172.

作者信息

醫藥局外人

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