基於CRISPR技術的工具或可進行大規模遺傳性篩查

知識 06-19

2016年6月18日訊 /生物谷BIOON/ --提及基因編輯技術，我們會立馬想到這兩年的明星技術—CRISPR/Cas9基因編輯系統，從某種意義上來講，該技術就如何科學家們製造的新型小汽車一樣，如今科學家們不僅僅是停留在製造這種「小汽車」的程度，而且科學家們已經開始開著小汽車開始兜風了。2012年底科學家們開始利用CRISPR/Cas9進行基因編輯，該技術可以沿著DNA在特殊位點進行切割，而需要藉助較短的導向RNA來將Cas9核酸內切酶運輸至特殊位點。

更有意思的是，目前很多研究團隊已經在大規模的遺傳篩查中開始這種技術，比如用該技術來鑒別驅動引發癌症對療法產生耐藥性的基因突變，或者快去評估藥物靶點的作用，而在遺傳篩查方面，RNA干擾技術遠沒有CRISPR/Cas9技術做得好，不管是在特異性還是效率上均是如此。

與此同時，MD安德森癌症研究中心的研究者Traver Hart等人就開始通過深入研究理解CRISPR/Cas9技術的能力及限制，如今CRISPR/Cas9工具箱一直在持續擴大，由博德研究所Zhang Feng及其它研究團隊的研究者所進行的喪失活性的Cas9可以同基因組進行結合并停止或增強基因的轉錄；如今Zhang Feng等人正在對Cas9酶類進行工程化操作來使其更具特異性並且尋找新型的基因編輯蛋白。

基於CRISPR技術的工具或可進行大規模遺傳性篩查

CRISPR技術上的研究進展

研究者Zhang Feng此前討論和如何對釀膿鏈球菌的Cas9蛋白進行工程化操作來改善其特異性，當DNA和導向RNA之間的配對並不完美時，Cas9核酸內切酶可以誘導脫靶突變，從而使其不能更加理想化在臨床中進行精確的基因組編輯。

DNA鏈需要分離來適應Cas9蛋白，研究者Zhang Feng的結構性分析揭示了Cas9蛋白中的正電荷凹槽，而在該位點帶負電荷的非目標DNA會與之相吻合，Zhang表示，如果可以中和其中一些正電荷，那麼就可以減弱蛋白的穩定性從而使Cas9蛋白變得更加特殊。研究者針對Cas9創建了32個單點突變，並且通過可以進行驗證但易錯的的導向RNA將每個單點突變對基因EMX1進行靶向作用，Cas9中的5個突變可以對基因EMX1進行目標編輯但會降低10倍脫靶位點的切口；隨後研究人員利用突變的Cas9對名為VEGFA基因進行切割，VEGFA基因可以被引導切割兩個此前已經鑒別的脫靶位點。

儘管所有突變的Cas9都可以降低脫靶效應，但研究者表示，他們可以結合這些突變使Cas9變得更加具有特異性。Zhang Feng博士將這些特異性增強的Cas9蛋白稱之為「eSpCas9突變體」，通過利用單點和三點突變的eSpCas9來檢測多個導向RNAs時，科學家們就發現，這兩種eSpCas9突變體都可以以相同的效率來對目標位點進行編輯，如今將多個突變的導向RNAs同野生型的Cas9進行結合，Zhang Feng博士的研究團隊在可以提供特異性的導向RNA的3』端發現了所謂的「種子區」，相比較而言，這種新型的eSpCas9突變體就可以將「種子區域」延伸至包括整個導向區域中，而且研究小組還將繼續努力研究使得這種新型系統變得更加具有特殊性。

基於CRISPR技術的工具或可進行大規模遺傳性篩查

利用CRISPR來探索未知的基因功能

CRISPR系統最大的一個特點就是解析特異性導向RNA的作用機制，而這就可以幫助開發出在既定基因內部靶向作用每一個基因位點或多個位點的CRISPRs導向的慢病毒文庫，隨後就可以轉換到細胞系中，從而就可以產生出單一基因既失活或被激活的細胞庫。為了闡明這些篩查技術的潛能，研究者Zhang帶領其研究團隊開始開發抵禦黑色素瘤的療法，BRAF V600E是一種已知的癌症突變，而且美國FDA已經批准利用藥物威羅菲尼（Zelboraf）來治療此類突變的黑色素瘤，然而耐藥性會在突變的細胞中快速產生，而且療法24周後腫瘤就會複發。

Zhang開發的CRISPR敲除文庫可以利用嚮導來靶向作用基因組中所有保守性的編碼外顯子，他表示，當設計出多種篩查實驗時，我們總會利用多個嚮導以確保實驗可以往下進行，同時任何一個嚮導的效率並不取決於脫靶修飾；隨後研究者試圖證實這些新型的候選者並且比較進行RNAi篩查的結果。如今研究者Zhang的實驗室希望通過鑒別可以用作基因組編輯的酶類來更深入研究，來擴大CRISPR的基因編輯工具庫，比如去年秋天他們發現了Cpf1，其作為另一種DNA內切酶，可以利用不同的切割活性裝備，從而更加有效地應用於基因編輯中，此外研究小組還描述了另外一種CRISPR/Cas系統C2c1， C2c2 and C2c3，而且目前正在研究該新型系統的作用機制。

基於CRISPR技術的工具或可進行大規模遺傳性篩查

在人類細胞系中利用遺傳篩查進行癌症靶向研究

基於RNAi的篩查技術可以在人類細胞中進行大尺度的微擾篩查，但對RNAi生物學機制的不完全理解以及篩查所產生的數據或許會產生一定的錯誤，刊登在Science上的一項研究報告中，來自MD安德森癌症研究中心的研究者Traver Hart對多種複雜的研究方法進行了論證來研究哺乳動物機體的基因功能。

此前在多倫多大學Jason Moffat的實驗室進行研究時，研究者Hart就制定出了一套金標準，該標準可以被用於評估RNAi技術和CRISPR遺傳篩查技術的質量；利用HCT116細胞系進行研究，研究者發現，CRISPR技術不僅非常敏感而且還不會產生額外的背景錯誤。

為何CRISPR技術會優於RNAi技術？CRISPR篩查技術可以在一系列具有生物學意義的基因表達水平上發揮作用，而shRNA（髮夾RNA）似乎僅會在基因的高水平表達下發揮作用。近日Hart的研究團隊開發了一種TKO文庫（Toronto KnockOut library），該文庫是一種可以靶向作用17661個人類編碼蛋白基因的第二代慢病毒編碼的導向RNA文庫。研究人員在四種癌症細胞系及一種正常細胞系中進行了適當的篩查，研究者將適應性或必要的基因視為一種微擾可以降低細胞生長和增殖，同時研究者還檢測到了將近1600個核心的適應性基因。

基於CRISPR技術的工具或可進行大規模遺傳性篩查

為了理解每種細胞系中特異性的弱點，研究者Hart減少了核心的要素並且進行了相關的功能性富集實驗。癌細胞系中核心必要基因或許就可以被開發作為潛在的療法靶點，2012年美國達納法伯癌症研究所(Dana-Farber Cancer Institute)的研究人員就通過研究發現，當突變的癌症細胞剔除掉了編碼腫瘤抑制基因的區域時，癌細胞就會去除多種「旅客」基因，而這些基因在癌症中並不扮演關鍵角色，但其或許會促進腫瘤細胞對特殊的損傷變得易感，這種概念就被稱之為「並行致死」效應，而且研究者認為其或許可以幫助在臨床上治療疾病。

剔除腫瘤抑制基因區域附近的核心必要基因或許為開發新型療法打開了一扇窗，比如POLR2A是一種可以編碼RNA聚合酶亞單位的核心必要基因，在卵巢癌中，該基因的拷貝幾乎總是與已知的腫瘤抑制基因TP53一起被剔除，而去年來自MD安德森癌症研究中心的研究者Xiongbin Lu就發現，TP53的缺失會使得結直腸癌細胞對聚合酶的抑制變得敏感。

核心必要基因的目錄還會一直增加，隨著更多研究人員進行大量關於CRISPR的篩查研究，而且這些研究會分散到基因組的各個位點中，同時隨著異質性拷貝在腫瘤中的缺失，其中一種或許就會變為新型的療法靶點；而這或將為癌症研究帶來一定幫助和曙光。（生物谷Bioon.com）

參考資料：

【1】Genetic Screens：A Route to Rapid Progress in Disease Targeting and Drug Development

【2】Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity

Sciencedoi：10.1126/science.aad5227

【3】Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells

Sciencedoi： 10.1126/science.1247005

【4】Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.

Naturedoi：10.1038/nature14136

【5】A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition.

Cancer Discovdoi：10.1158/2159-8290.CD-12-0470

【6】Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.