Western Blot實驗中那些炫彩表象下的本質

作者：解螺旋·毛博

如需轉載請註明來源：解螺旋·醫生科研助手

導語

Western blot實驗是很常用的一種實驗，常用於定量或者定性確定組織或者細胞中蛋白質的表達情況。這裡和大家分享一下毛博做Western的心得體會，更有經典的protcol獻上。除了心得體會，還有Western常見問題，以及可能原因分析。都是滿滿的乾貨喲。

參考文獻選一抗

做Western blot實驗，一抗非常非常重要。如果一抗選擇的不好，神仙也做不出來Western。進口的抗體太貴；國產的抗體不好用。進口抗體一般不會出現問題。市場上知名的幾家公司，包括ABCAM，Sigma，CST，Santa Cruz等公司，質量都不錯。進口抗體國內分裝和國產抗體，質量實在不敢恭維。讓人已經無力吐槽。

抗體的選擇，毛博有個百試不爽的竅門。那就是——文獻大法。找一些你的專業方向的經典文獻。然後，看文獻裡面是不是和你的實驗用的是同樣的組織同樣的細胞，看文獻裡面的Western blot的條帶清不清楚，邊緣銳利不銳利，最後看文獻裡面用的是哪個公司的抗體。直接購買即可。

Western Blot實驗試劑選擇

毛博我是按ABCAM公司的經典protocol做的。這裡給大家提供一個網址，以供下載（http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf）。

抗體的說明書大家要仔細看。不同的抗體公司推薦的配置的方法是不一樣的，比如CST的gamma-H2AX抗體需要用脫脂奶粉配置，而有些公司卻要求用BSA配置。

封閉用的奶粉看似簡單，其實很重要。如果要湊合，可以到超市買光明牌脫脂奶粉。但是不建議這麼做。因為封閉要在室溫下過夜的，如果是夏天的話，第二天過來都變成酸奶了。還怎麼接著往下做實驗呀。其實現在，一般實驗用專門封閉的奶粉也不貴。一大罐可以用很久了。

內參抗體的選擇

在Western blot實驗中，用的最多的是內參抗體。作為重要的參照系，只要一開始做Western，不管什麼蛋白質，肯定要用內參抗體。這裡，毛博強烈推薦GAPDH。國外大牌雜誌上發表的牛論文一般都是用的GAPDH。大牛實驗室都用的，肯定錯不了。毛博推薦Minipore公司的。因為確實好用。

以上和大家分享了毛博做Western的三點經驗體會。下面再談談新手在做Western的時候，會遇到的常見問題和可能的原因。

空空如也，轉完膜沒條帶怎麼辦

新手在做Western的時候，有時候轉完膜後，膜上面沒有任何條帶，白茫茫一片大地真乾淨！這又是什麼原因呢？

這個時候，最大的可能就要考慮是不是膜裝反了。不要笑哈。這其實是新手最容易犯的錯誤。膜反了，直接就沒有轉上去。如下圖所示，要把夾子的黑面對著轉移槽的黑面；夾子的白面對著轉移槽的紅面。

暗夜流星，片子熠熠生輝是好事嗎？

新手在做Western的時候，有時候會走向另外一個極端，整張片子都熠熠生輝。像划過暗夜的流星，茫茫大海的燈塔一樣。但是，這不是指引你走向成功和勝利哈。而是指引你走向失敗和延期畢業。

這種情況，一般是二抗的濃度太高了。導致和一抗結合的二抗太多了，或者加了二抗孵育之後，洗得時間不夠長，洗不幹凈，導致整個膜上面都結合上了二抗。解決辦法就是稀釋二抗，好好洗白白。二抗稀釋多少倍才合適呢？這個要靠摸條件，1：1000，1：2000，1：4000，幾個梯度都試一試。

別以為「有背景」都是福！

在中國這個社會，做人有背景有資源有靠山，是一件好事；做Western有背景，可是一件壞事哈。看看下面這個圖，黑乎乎的，難看死了。曾經發生過老闆將這種膜直接扔下樓，然後讓研究生下去撿上來的慘劇。

發生這個情況，一般都是封閉沒有封閉完全，或者漂洗沒有漂洗乾淨的問題。封閉的話，5%脫脂牛奶或者BSA 4°C過夜。漂洗的話，室溫下至少1小時，用脫色搖床多震蕩。

毛博最後再嘮叨一句，Western實驗是一個需要耐心和細緻的實驗。每一個步驟都要小心翼翼，注意細節。

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