Science：重磅！史上首次利用CRISPR-Cas9讓人細胞變身為記憶存儲系統

在一項新的研究中，來自美國麻省理工學院（MIT）的研究人員設計出一種方法在人細胞的DNA中記錄複雜的歷史事件，從而允許他們通過對這種DNA進行測序從中找回過去事件的「記憶」。相關研究結果於2016年8月18日在線發表在Science期刊上，論文標題為「Continuous genetic recording with self-targeting CRISPR-Cas in human cells」。論文通信作者為MIT電學工程與計算機科學副教授和生物工程副教授Timothy Lu。論文第一作者為Samuel Perli博士和研究生Cheryl Cui。

這種模擬記憶儲存系統---首先能夠在人細胞中記錄事件的持續時間和/或強度---可能也能夠允許科學家們研究幹細胞在胚胎髮育期間如何產生多種組織，細胞如何對環境條件作出反應以及它們如何發生導致疾病產生的基因變化。

Lu說，「為了能夠更加深入地理解生物學，我們對人細胞進行基因改造，使得它們能夠基於基因編碼的記錄器報道它們自己的歷史事件。」他補充道，這種技術應當允許深入認識基因調節和細胞內發生的其他事件如何導致疾病產生和發育。

模擬存儲器

包括Lu在內的很多科學家已開發出多種方法在活細胞中記錄數字信息。他們利用重組酶對細胞進行編程，使得它們在一種特定的事件發生---如接觸一種特定的化學物---時翻轉它們的DNA片段。然而，這些方法僅揭示出這種事件是否發生，而不能揭示出接觸多少數量的化學物或者這種接觸持續多長時間。

Lu和其他的科學家之前設計出方法在細菌中記錄模擬信息，但是迄今為止，還沒有人在人細胞中做到這一點。

在當前的這項研究中，由MIT開發出的這種新方法是基於基因組編輯系統CRISPR-Cas9實現的，其中這種系統是由一種DNA切割酶Cas9和一種引導這種酶結合到基因組特定位點上並指導它在這個位點進行切割的短鏈RNA---也被稱作嚮導RNA（gRNA）---組成的。

CRISPR-Cas9被廣泛地用於基因編輯，但是Lu團隊決定對它進行改編用於記憶儲存。在最初進化出CRISPR-Cas9的細菌中，這種基因組編輯系統記錄過去的病毒感染，這樣細菌細胞就能夠識別和抵抗再次入侵的病毒。

Perli說，「我們對這種CRISPR-Cas9系統進行改編以便在人基因組中儲存信息。」

當利用CRISPR-Cas9對基因進行編輯時，研究人員構建出能夠匹配宿主基因組中靶序列的gRNA。為了進行記憶編碼，他們採取一種不同的方法：他們設計出識別編碼這種gRNA的DNA序列的gRNA，從而產生他們稱之為「自我靶向的gRNA（self-targeting guide RNA）」。

在這種自我靶向的gRNA的引導下，Cas9切割編碼這種gRNA的DNA序列，產生一種永久性記錄事件發生的突變。這種DNA序列一旦發生突變就會產生新的gRNA來引導Cas9靶向這種新近發生突變的DNA序列，而且只要Cas9是有活性的或者這種自我靶向的RNA仍然表達，就允許突變進一步發生和積累。

通過細胞內的感應器檢測特定生物事件發生來調節Cas9或自我靶向的gRNA的活性，這種系統就能夠允許累進性突變作為這些生物事件的函數積累下來，因而提供基因組編碼記憶。

比如，研究人員對一種基因迴路進行改造，使得它僅當靶分子--如炎症期間免疫細胞產生的TNF-α---存在時表達Cas9。每當TNF-α存在時，Cas9切割這種編碼gRNA的DNA序列，產生突變。接觸TNF-α的時間越長或者TNF-α濃度越大，這種DNA序列就會積累越多的突變。隨後通過對這種DNA序列進行測序，研究人員能夠確定接觸多少數量的TNF-α。

Perli說，「這就是我們一直在尋找的模擬行為：當增加TNF-α的接觸時間或數量時，就能夠增加突變發生的數量。」

Cui說，「再者，我們想要在活的動物體內測試我們的系統。能夠在小鼠的活細胞中記錄和提取信息能夠有助解答有意義的生物學問題。」研究人員證實這種系統能夠記錄小鼠體內的炎症。

大多數突變導致這種DNA序列發生部分缺失，因此研究人員讓他們設計的gRNA長度比通常的20nt（20核苷酸）要長，因此它們不會變得太短而不能發揮功能。長40nt的DNA序列比人細胞記錄一個月發生的事件所需的足夠長的DNA序列還要長，而且研究人員還設計出長70nt的DNA序列，它們能夠被用來記錄更長時間發生的生物學信號。

追蹤發育和疾病

研究人員也證實他們能夠通過導入多種自我靶向的gRNA對人細胞進行基因改造，使得它們同時檢測和記錄至少兩種生物學事件。每種gRNA與一種特定的事件相關聯，而且僅當這種事件發生時才產生。在這項研究中，研究人員證實他們能夠記錄抗生素強力黴素和一種被稱作IPTG的分子的存在。

研究人員說，這種方法當前最有可能被用來研究人細胞、組織或工程器官。通過對人細胞進行編程使得它們記錄多種事件，科學家們能夠利用這種系統監控炎症或感染，或者監控癌症進展。它也可能被用來追蹤幹細胞在動物從胚胎髮育到成年時如何產生不同的組織。

Perli說，「利用這種技術，你能夠擁有不同的存儲寄存器來記錄細胞接觸到的不同信號，而且你能夠觀察到這種細胞接收到的每種信號的持續時間或強度。這樣你能夠更加接近一步理解在發育中發生什麼。」

Continuous genetic recording with self-targeting CRISPR-Cas in human cells

Samuel D. Perli, Cheryl H. Cui, Timothy K. Lu

doi:10.1126/science.aag0511

PMC:

PMID:

The ability to record molecular events in vivo would enable monitoring of signaling dynamics within cellular niches and critical factors that orchestrate cellular behavior. We present a self-contained analog memory device for longitudinal recording of molecular stimuli into DNA mutations in human cells. This device consists of a self-targeting guide RNA (stgRNA) that repeatedly directs Streptococcus pyogenes Cas9 nuclease activity toward the DNA that encodes the stgRNA, thereby enabling localized, continuous DNA mutagenesis as a function of stgRNA expression. We demonstrate programmable and multiplexed memory storage in human cells triggered by exogenous inducers or inflammation, both in vitro and in vivo. This tool, Mammalian Synthetic Cellular Recorder Integrating Biological Events (mSCRIBE), provides a unique strategy for investigating cell biology in vivo and enables continuous evolution of targeted DNA sequences.

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