養血清腦顆粒質量控制中：斑馬魚神經元損傷模型的應用分析

瀋陽藥科大學 孫國祥、李曉穩

中藥質量控制的最終目的是保證中藥的安全性和有效性，而現行質量控制方法主要用於評價其表觀成分的一致性，不僅無法關聯藥效或毒副作用，且存在被勾兌的風險。同時，表觀化學成分的重現也可能導致對樣品質量合格與否的誤判，潛在風險更大。生物活性測定法因具有整體可控、藥效相關等技術優勢，作為符合中醫藥特點的適用質量控制模式及方法，漸已成為中藥質量控制和評價的重要發展方向之一。近日，瀋陽藥科大學孫國祥教授等在《中國實驗方劑學雜誌》[2016；22(9):1]發表了一項研究[國家「重大新葯創製」科技重大專項（2013ZX09402202）]，旨在探討斑馬魚神經元損傷模型在養血清腦顆粒質量控制應用的可行性，結果提示，採用斑馬魚神經元損傷模型評價養血清腦顆粒神經細胞保護作用的方法快速、穩定可靠，可作為現有質量控制方法的有效補充，為中藥的生物活性質量控制研究提供了一定的技術參考。現整理文章主要內容與讀者分享。

背景及方法

背景

國家藥典委員會已明確表示，中藥質量標準逐步由單一指標成分定性定量測定開始向活性有效成分及生物檢定的綜合檢測過渡。美國植物葯指南中關於藥材、提取物、製劑的質量標準制定中也一直強調增加生物測試項目。說明生物活性測定方法可有效彌補現行化學成分層面難以全面監控中藥復方質量的局限性。前期研究中，本課題組已成功將斑馬魚模型應用於藥物藥效學、毒理學及藥物代謝研究中。

養血清腦顆粒是在四物湯的基礎上，以當歸、川芎、鉤藤、白芍、夏枯草等11 味中藥組方而成，具有養血平肝、活絡止痛的功效，主要用於血虛肝旺所致頭痛、眩暈眼花、心煩易怒及失眠多夢，是中藥保護品種。本實驗以斑馬魚神經元損傷模型作為生物模型載體，對不同批次的養血清腦顆粒的生物活性進行檢測，初步探索中藥復方質量標準中建立生物活性測定項目的可行性，為其他藥效物質不清楚的中藥復方生物活性質量控制研究提供參考。

方法

供試品溶液的製備

取不同批次養血清腦顆粒2.0 g，用100 ml 水溶解，得20 g/L母液，置4 ℃冰箱中，備用；用水稀釋到相應質量濃度進行藥效活性檢測。

養血清腦顆粒的神經細胞保護藥效測試

選用受精1 d 的野生型AB系斑馬魚胚胎，將受精24 h斑馬魚胚胎放入6孔板中，加入培養基3 ml，每孔加入幼魚胚胎30條，嗎替麥考酚酯誘導斑馬魚中樞神經損傷建立模型。無藥物治療組為模型組，0.1%二甲基亞碸為空白組，0.50 mol/L 還原型谷胱甘肽（GSH）為陽性組，選擇S1 養血製劑樣品用於方法建立；配製不同濃度的S1 樣品作為受試組，造模同時分別加入不同濃度S1 樣品處理24 h。藥物處理結束後，使用0.64 mmol/L 三卡因甲磺酸對斑馬魚進行過度暴露處死；用吖啶橙（AO）染料對斑馬魚胚胎進行活體染色1 h；染色結束後在熒光顯微鏡下觀察、拍照。統計斑馬魚凋亡細胞熒光強度（F），定量評價養血清腦顆粒神經細胞保護效果。參照生物檢定的要求，運用建立的方法檢測不同批養血清腦顆粒製劑的神經細胞保護藥效。

主要結果

養血清腦顆粒對斑馬魚神經細胞保護的量效關係考察

將20 g/L養血清腦顆粒工作參照物S1 用水分別稀釋至1.00、0.75、0.50、0.25、0.10 g/L，各5 ml，測定養血清腦顆粒處理下斑馬魚凋亡細胞（F），計算神經細胞保護率（P）（表1）。

空白組斑馬魚中樞神經細胞凋亡較少，凋亡細胞熒光信號弱；模型組斑馬魚中樞神經凋亡細胞非常明顯。陽性組與模型組相比，斑馬魚中樞神經凋亡細胞顯著減少。以藥物質量濃度（C）為橫坐標，P為縱坐標，通過試驗數據進行線性回歸和計算得回歸方程P=0.082C +4.439（r=0.995），表明在0.10~1.00 g/L內養血清腦顆粒與P 成良好線性關係。利用GraphPad 5.0 軟體擬合量-效曲線，計算養血清腦顆粒對斑馬魚神經細胞保護作用的半數有效濃度（EC50）522 mg/L，故選擇給葯質量濃度522 mg/L。

方法學考察

精密度實驗

分別平行製備3批養血清腦顆粒（S1、S2、S3）樣品3 份，進行日內精密度考察，重複操作6次。結果不同批次製劑的P 平均值分別為62.9%、62.3%、63.5%，無明顯差異，相對標準偏差（RSD）為2.2%~3.7%。日間精密度考察採用同一批養血清腦顆粒對3個不同批次斑馬魚P測定，結果RSD為1.2%。

重複性實驗

平行製備養血清腦顆粒（S1）6份，分別處理同一批次的斑馬魚24 h，不同樣品處理後均有明顯的神經細胞保護藥效，且6個樣品處理組斑馬魚的P 均無顯著性差異，RSD 為8.4%。

穩定性考察

分別於0、3、6、12、24 h將室溫放置的同一供試品溶液進行生物藥效活性檢測，計算RSD為4.9%，說明室溫放置24 h內穩定。

神經細胞保護藥效的測定

測定不同批次的養血清腦顆粒的神經細胞保護藥效，包括在效期內的6批製劑、3批過期製劑、3批經破壞後的製劑（分別為高溫、光照和10% H2O2破壞後樣品）（表2）。結果發現不同條件下的樣品對斑馬魚神經細胞保護藥效有明顯差異，樣品S1~S6 具有顯著的神經細胞保護作用；樣品S7~S9的P較低；樣品S10~S12的P差異較大；提示通過斑馬魚神經細胞保護藥效活性測定可定性表徵養血清腦顆粒質量的優劣。

討論

前期藥理研究表明養血清腦顆粒通過選擇性地抑制谷氨酸和Caspase-3的表達，並且通過谷氨酸鹽合成酶選擇性抑制興奮性氨基酸谷氨酸的神經毒性作用，減少神經細胞的死亡，從而發揮神經保護作用。根據養血清腦顆粒的神經保護機制，選擇同樣是通過抑制谷氨酸表達而發揮神經元保護作用的GSH 為陽性葯。

斑馬魚具有典型的脊椎動物腦部特徵，神經行為遵循順序發育原則。與嚙齒動物模型相比，斑馬魚具有飼養經濟、產卵量大、發育快速、胚胎透明、易於觀察、動物產生的應激少及實驗結果較客觀等優點。目前模式動物斑馬魚已廣泛應用於神經發育、神經損傷和神經行為學等神經科學研究。因此，本文採用標準化的斑馬魚神經元損傷藥效模型，採用AO 染色與凋亡細胞熒光強度定量分析，對藥物的體內神經細胞保護效率進行評價。在本文研究中，斑馬魚神經損傷模型作為心腦血管藥物生物學內控檢測方法具有較好的精密度和重複性，還具有關聯藥效、可測可評的特點。研究發現合格製劑均具有顯著的神經保護效率，過期及破壞性樣品的神經保護效率則大大降低，表明該方法可初步用於區分合格與不合格樣品。

中藥成分複雜，單純效仿化學葯基於成分論的質量控制模式，對於物質基礎不明的中藥很難控制臨床上的有效性和安全性。因此，將生物測定引入到中藥質量控制與品質評價中是未來的重要發展方向。本文建立的斑馬魚神經損傷模型具有簡便、快速、穩定、有效的優點，可為養血清腦顆粒的質量控制和品質評價提供新思路和技術支持。

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