「點亮了生物學」的故事 | 致敬錢永健

知識 09-02

?錢永健。來源：hhmi

編者按：

熒光蛋白標記神經細胞是研究大腦的一項重要的工具，帶動了腦彩虹等技術的發展。剛剛去世的華裔科學家錢永健則為改造綠色熒光蛋白做出了重要的工作，改變了熒光蛋白分子的一個氨基酸，使其發光更強、更穩定。

美國喬治城大學吳建永教授曾在2014年介紹腦彩虹技術時著重介紹了熒光蛋白的故事。為紀念錢永健博士對科學的卓越貢獻，吳建永重新作了較大修訂後由《知識分子》轉載刊發。

「他做出了很多成就，將被世人所銘記。」錢永健夫人Wendy如是說。

撰文 | 吳建永（美國喬治城大學醫學院神經科學系教授）

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題記

錢永健教授突然辭世，消息瞬間刷屏。錢的主要貢獻是「點亮了生物學」。他獲得諾貝爾獎的工作是開發熒光蛋白，但業內人認為他還有更重要，更值得獲獎的貢獻。但這沒有關係，諾貝爾獎也是外行誇獎內行。愛因斯坦不也沒有因為相對論獲獎嗎？下面講幾個小故事，幫大家捋順一下怎樣「點亮了」生物學，點亮為什麼重要。

所謂「點亮了」生物學，就是讓少數細胞在數億細胞組成的系統中里亮起來，或者某些分子在細胞億萬個分子中亮起來。亮起來就能看見，從而結束了生物學家的「瞎摸」時代。

舉個例子，數以億計的神經細胞默默地在神經系統的各個部門工作。神經細胞緊緊地擠在一起，像森林裡的大樹那樣枝叉互相交織纏繞。在枝杈頂端，不同的神經細胞相互接觸並傳遞信息。腦子能想事情，關鍵就靠神經細胞之間錯綜交織的聯繫。在大腦皮層里，每個神經細胞大約要把信息送給幾千個其他細胞，同時每個細胞也要接受並處理從幾千個神經細胞來的信息。可是神經細胞之間的相互聯確是很難看清楚的，就像在飛機上用望遠鏡看森林，雖然可以看見樹，但是當樹枝交叉在一起的時候，就只能看見一片蔥綠，而分不清哪枝來自哪棵樹。因此在普通顯微鏡下腦組織看起來就像肉凍，分不清單個的神經細胞，只能模模糊糊地看到一些由於神經細胞整齊排列形成的層狀結構。如果一個或一類細胞亮了起來，就可以大大幫助腦的研究。

錢教授的主要貢獻就是：

1. 開發了一種方法，讓正在活動的神經細胞亮起來（鈣成像）；

2. 開發了熒光蛋白，讓實驗者可以按需要把讓不同的神經細胞按其特徵發光（圖一）。

?圖一用腦彩虹技術拍攝的神經細胞。圖中彩色圓圈是神經細胞胞體，胞體連接的樹枝狀結構是細胞的突觸。由於每個細胞都有一個獨特的顏色，可以利用圖像處理技術把相互交叉的突觸看清。來源：wired.co.uk

熒光蛋白的故事

那麼怎樣讓蛋白或其他生物大分子出現彩色的熒光呢？這是一個深刻的問題。用熒光蛋白標記神經細胞是研究大腦的一項重要的工具。因此在最近二十多年以來開發不同顏色的熒光蛋白，並提高熒光的亮度就成了神經科學研究中的一個重要研究領域。

先簡單講講熒光的原理：我們知道原子周圍環繞著電子云。電子云攜帶的能量隨其形狀不同而變化。電子云可以和光子相互作用，吸收一個光子而變成帶有更高能量的形狀，也可以高能量形狀通過放出一個光子而變成低能量的形狀。這種與光子交換產生電子云形狀變化的術語叫作「能級躍遷」。一般當電子云吸收一個短波長的光子後會向高能量級躍遷，然後再變回基態給出一個長波長的光子。所謂熒光就是原子云吸收一個短波長光子（紫外光）之後再給出一個長波長光子（藍黃紅等可見光）的過程。讓神經細胞產生不同顏色的熒光牽涉兩個關鍵問題，一是怎樣讓大分子產生不同顏色，二是怎樣讓基因攜帶這種大分子。

在發現熒光蛋白之前雖然人們已經知道許多無機礦物和有機染料可以產生熒光，但是這些物質都不能被基因攜帶進大腦到發育過程。這是因為基因只能攜帶並讓細胞表達蛋白質類的生物大分子。能產生熒光的蛋白在開始時並不是人可以設計出來的，因為蛋白質的分子是由一串氨基酸構成，氨基酸鏈扭轉摺疊形成複雜的三維結構，在能與光子作用的「生色基團」附近如果有其他的分子，會在很大程度上影響熒光的亮度和顏色。所以，在熒光蛋白研究領域裡的第一推動來自於自然界的一個熒光蛋白。這第一個蛋白由日本科學家下村修（Osamu Shimomura）發現。

1958年，下村修在作碩士論文的時候發現水母中的一種蛋白在碰到水的時候會發出綠色的熒光。隨後下村修繼續此項研究並在1960 年代（他在普林斯頓大學做博士後）純化了水母中的綠色熒光蛋白（圖二）。

?圖二從1960年代開始，下村(上圖後面站立的小夥子)在他的家人和朋友幫助下在太平洋沿岸採集可以在黑暗中發光的水母(中圖)，來源：諾獎網站、ecoxotic.com。下圖：下村修用來切水母傘體下緣的機器，由他當時的老闆Frank Johnson設計。

下村修發現的熒光蛋白在1994年被哥倫比亞大學的查爾菲（Martin Chalfie）在其他物種中表達，由此證明這種蛋白可以脫離水母中的各種酶系統而獨立地發出熒光。可是，天然綠色熒光蛋白還不能作為一種有效的研究工具，因為它的分子對環境敏感，而且發光的強度較弱且不穩定。但是在這個天然的蛋白分子的啟發下，幾個研究小組開始利用分子生物學手段改變蛋白分子的氨基酸鏈以增加發光的效率。 1995年，Roger Tsien（錢永健，錢學森的堂侄，加州大學，聖迭戈）發現改變此蛋白分子上一個氨基酸後可以使其發光大大加強，並且十分穩定。沿著這個思路在那幾年出現了一個「熒光蛋白熱」，幾個研究小組使用這種方法來改變天然的綠色熒光蛋白，使其不但更亮更穩定，而且產生藍，黃，青等不同顏色。經過十幾年不懈的努力，各種熒光蛋白終於加入了神經科學家的功具箱。2008年，下村修，查爾菲和錢永健因為在熒光蛋白方面的貢獻分享了諾貝爾化學獎（圖三）。

說起來改進天然熒光蛋白的方法並不是靠研究者「拍腦袋」式的聰明設計，而是靠「大躍進」式的隨機亂搞。這是因為我們現代的量子力學還遠遠不足以設計大分子的電子云。所以用隨機改變的方法反而顯得更聰明且高效。在改進天然熒光蛋白的過程首先是把水母綠色熒光蛋白基因轉接在細菌的DNA鏈上，然後讓細菌一變二，二變四地指數率增殖。每次細菌增殖時其整個DNA鏈都會複製自己，而複製都有可能出現錯誤。這樣隨機產生的錯誤也會出現在熒光蛋白的DNA代碼上，進而在DNA翻譯成蛋白的時候氨基酸鏈也會出現相應的改變。這樣，在一個培養皿里種上幾個細菌，在合適的營養和溫度之下細菌幾十分鐘就能繁殖一代。如此一夜時間就會繁殖幾十代，由一個細菌變成幾億個。在這幾億個細菌中攜帶的熒光蛋白中也會很多個隨機的突變。絕大多數突變是無意義的，即不會改變顏色或亮度。但是在上萬個培養皿中，幾千億萬億個突變事例里可能會出現個別有意義的突變，這樣研究者就能在紫外燈下看到一個亮點，或「萬綠從中一點紅」這樣的顏色改變。由此可以把這個有意思的細菌揀出來，進行下一步篩選。

?圖三由於研究熒光蛋白工作獲得諾貝爾獎的學者。左起：查爾菲、下村修、錢永健。來源：聖迭戈大學

從這種研究方法上我們看到研究者利用了自然界進化的「突變－選擇」的方法，只不過把自然界中需要多少萬年發生的事加速到了幾年，在實驗內利用細菌快速繁殖傳代的特點達到目的。實際上水母也是靠進化的辦法產生了綠色熒光蛋白，在黑暗的深海里造出了吸引魚類的小燈籠，從而帶來營養以利自身的生存。

在1990年代我曾經在美國東岸的伍茲霍海洋生物站（Woodshole Marine biological labs）工作過七個夏天。伍茲霍的夏天是神經科學的聖地，在這個生物站開展的工作曾多次獲得諾貝爾獎。在涼爽的夏夜，小鎮的飯館酒吧里坐滿神經科學家，臉紅脖粗的爭論和高聲喧嘩的打賭聲中充滿了神經科學的術語。在小路上我曾多次與下村修不期而遇，互相點頭致意。這是位樸實無華的退休老人是生物站的榮譽終生教授。我深深地記得他在做報告時會讓坐在門口的聽眾把屋裡的燈全都關掉，在黑暗中他從口袋中摸出兩隻試管，把兩種溶液混合在一起，產生幽幽鬼火似的藍光。在他得獎前，年復一年，他不斷地重複著那六十年代的輝煌。我這樣的老聽眾也會和新來的學生一起，一遍又一遍地享受著那有趣的「祥林嫂故事」。錢永健的報告呢？當然也聽過。屬於那種中氣十足，高潮迭起，每樣都能上Nature，Science那種頂級雜誌的工作。在伍茲霍的夏天每周都有幾次當紅大牛的報告，聽多了也會打瞌睡的。

熒光蛋白的諾貝爾獎還有一個與其「擦肩而過」的悲崔故事。同在伍茲霍海洋生物站工作，首次克隆出綠色熒光蛋白的人不但沒有得到諾貝爾獎，反而因生計所迫而離開了研究領域，變成了一個客車司機。他叫普拉舍（Douglas Prasher），1979年的博士，1983年到伍茲霍工作。據美國國家公共電台（National public Radio, NPR）的採訪，1988年普拉捨得到美國癌症協會的一筆基金，開始進行克隆綠色熒光蛋白的工作。在今天看來，克隆天然的綠色熒光蛋白是此領域的一個必要的里程碑。他於1992年成功地完成了這個項目，並把克隆出的結果給了查爾菲，錢和其他幾百位科學家。可是，當兩年後基金用完後他又去申請NIH（美國國立衛生研究所）的基金時被拒了。當時普拉舍正在努力通過終身教授的程序，沒拿到NIH基金算是個硬傷，於是他不得不改行，轉到另一個研究機構美國農業部，搞一個不相干的動植物檢疫工作。隨著美國研究資金的不斷削減，普拉舍幾年內輾轉幾個技術工作，最後到了NASA（美國空間與太空總署）。然後由於NASA基金的裁減他就完全離開了科研領域，到當地一個汽車行當接送客人的司機。一個小時只掙8塊五（圖四）。

普拉舍的故事告訴我們不要成天抱怨自己的工作與諾貝爾獎「擦肩而過」。就算是你做的就是諾爾獎的里程碑式工作，也不見得就能申請到研究基金，就算得到基金，也不見得能得到終生教授，就算到了終生教授，也不見得還能得到基金繼續做科研。

?圖四上圖：道格·普拉舍(Douglas Prasher)站在他的送客車前。後來他的故事廣為流傳，終得好人幫助，據說現在已經重回科研崗業。來源：nytimes.com。下圖：Prasher於1992年發表的「歷史上最悲壯的論文」。

五顏六色的熒光蛋白不但是研究大腦的有力工具，也逐漸進入市場變成具有商業價值的商品。下圖所示的是一種轉有熒光蛋白基因的斑馬魚，可以在水族箱的紫外燈下發出各種顏色的美麗熒光。

?圖五上圖，五顏六色的轉基因斑馬魚。下：由錢實驗室開發的各色熒光蛋白(上圖來自：exotic-aquariums.com，下圖來自諾獎官網)

腦彩虹技術

斑馬魚都可以五顏六色，那麼把這種五顏六色放到腦子了是什麼情況呢？這就是腦彩虹（brain bow）技術，看清神經細胞的一項美麗的技術，由哈佛醫學院的理奇曼（Jeff W. Lichtman）和三思（ Joshua R. Sanes）小組於2007年發明。從圖一可以看到，利用此技術看到的神經細胞每個的顏色都是獨一無二的。雖然很多細胞看起來都是紅的，但這個偏點黃，那個偏一點青，還有一個的偏一些紫。這樣通過計算機的顏色識別技術就能完全識別每個神經細胞。追蹤他們的每個細小的分叉。哪怕他們緊密排列，分支互相交織纏繞。

腦彩虹技術的原理和彩色電視中的三原色技術類似。電視的顯示屏上雖然只有紅綠藍三種熒光粉，但通過調整每種熒光顏色的亮度，可以配比出萬紫千紅的各種顏色。同樣，用腦彩虹技術可以讓紅綠黃藍青等幾種熒光蛋白出現在小鼠的每個腦細胞上。所謂熒光蛋白就是在紫外光下能發出彩色熒光的生物大分子。生物大分子的藍圖可以由基因攜帶。通過轉基因技術讓小鼠的神經細胞攜帶熒光蛋白的基因，就能神經細胞在熒光顯微鏡的紫外線照射下發出珣麗色彩。但怎樣讓每個不同的神經細胞發出不同顏色的熒光呢？這就是腦彩虹技術的聰明之處。

我們知道動物的整個身體是從一個受精卵發育而成的。在胚胎髮育早期，每個細胞都是全能的,就是所謂幹細胞，每個都有潛能發育成身體上的不同器官。在胚胎髮育時幹細胞一變二，二變四，數量快速增加，胚胎的形狀也從一團細胞變成一個管子。然後管子的背面出現一個皺褶，皺褶變成神經管，出現一小群專一能發育成神經細胞的神經幹細胞。神經管最後發育成脊髓，脊髓的前端膨大成大腦。追蹤神經系統發育的過程中每一個細胞的命運和走向一直是神經科學中的一個重要領域。

理奇曼-三思小組利用轉基因技術中的Cre-Lox recombination方法，在神經系統發育早期讓每個神經幹細胞都攜帶上很多套熒光蛋白的基因，在每套基因內都含有紅黃藍三種熒光蛋白的編碼，並讓每套基因都有「重組」的機會。在重組的時候，可以把基因內某個熒光蛋白的編碼刪掉。這樣，幹細胞每次增殖時會出現一次重組，如果在重組時丟掉了一個藍色蛋白的密碼，細胞的熒光就會偏綠（紅黃色多些）。同樣，如果丟掉了一個紅色蛋白基因，細胞顏色就會偏向黃藍組合的青色。從神經幹細胞發育到成熟的大腦需要有多次幹細胞增殖，每次增殖時細胞的顏色都會出現一些變化。幹細胞每次增殖都會產生兩個一模一樣的姊妹細胞，她們的基因一模一樣，顏色也是一樣的。而每個姊妹細胞的下一步增殖，顏色就會由於基因重組丟失不同的熒光蛋白而進一步變化。最後達到每個成熟的神經細胞都會攜帶一個獨特的紅黃藍熒光蛋白比例，形成圖一見到的美麗腦彩虹。

這種用Cre-Lox方法產生基因隨機比例的方法見圖六，更詳細的解釋可以讀他們在2007年發表於Nature的原始文獻。

?圖六用Cre-Lox隨機重組技術產生隨機的顏色比例。圖中上面的鏈條表示一段帶有紅，黃，藍三種熒光蛋白的基因，在熒光蛋白的基因之間有兩個lox開關（lox2272和loxP）。這個基因只能表達最左邊的熒光蛋白。因此在不出現重組時只表達紅色熒光蛋白（上面紅圈）。在出現cre-lox基因重組的時候可以甩掉兩個相同開關之間的一段DNA。這樣如果甩lox2272之間的一段（紅熒光蛋白）就會表達黃色熒光蛋白（中間黃圈）; 如果甩掉loxP之間的一段（紅，黃熒光蛋白）就只剩下藍色蛋白，（下面青圈）在轉基因過程中有多個相同相同的DNA 片斷轉進細胞，每個都隨機地重組留下不同的片段，這樣每個細胞就會表達不同數量的熒光蛋白。（改畫自他們Nature文章的圖一A. )

腦彩虹技術只是人類認識大腦過程中的一個美麗的故事。在神經科學研究過程中，每一個里程碑之下都有多少美麗和悲傷的故事。但我寫一個小故事也需要一天甚至幾天，所以我每次動筆前都很糾結應該先寫哪個故事。

腦彩虹技術發明只有短短几年，已經有上千篇研究文章。其主要的用途之一是幫助科學家追蹤辨識胚胎中的神經細胞，怎樣一路艱辛地發育成一個健康的大腦。在浩瀚的神經科學領域，這個技術只是利用光學方法研究大腦的一個事例。看了這個故事讀者可能會問，既然能用熒光來看清糾纏在一起的神經線路，那麼我們能否用光學方法看到神經細胞的活動？這就是錢永健教授的另一項重要貢獻，說來話長，只好且聽下回分解了。