NEB內切酶攻略
酶切反應條件的優化當建立內切酶酶切反應體系時有幾個關鍵因素需要考慮。比如，如何在反應體系中加入適量的 DNA、內切酶和緩衝液，就可以獲得最佳酶切效果。根據定義，在 50 μl 反應體系中，1 單位的限制性內切酶可以在 60 分鐘內完全切割 1 μg 的底物 DNA。上述酶、DNA 與總反應體積的比值可以作為建立反應體系的參考數據。但是，目前大多數科研人員會遵循下表中所列的標準反應條件，使用 5-10 倍過量酶切 DNA，這樣有利於克服由於 DNA 來源不同、質量和純度不同而造成的不利因素。省時反應體系用於帶有 Time-Saver 標記的限制性內切酶，省時內切酶可以在 5-15 分鐘切割 DNA。此外，RE-Mix 限制性內切酶預混液也可以使用。NEB 整理了以下有關內切酶反應的經驗和技巧，以幫助您實現最佳酶切效果。
標準反應體系：
限制性內切酶 10 units*
DNA 1 μg
10X NEBuffer 5 μl (1X)
總反應體系 50 μl
溫育溫度 因酶而異
溫育時間 60 分鐘
*足夠切割所有類型的 DNA。
省時酶切反應體系：
限制性內切酶 1 μl
DNA 1 μg
10X NEBuffer 5 μl (1X)
總反應體系 50 μl
溫育溫度 因酶而異
溫育時間 5-10 分鐘*
*具有省時酶切特性的內切酶也可以過夜反應而沒有星號活性。
內切酶
? 從冰箱取出後請一直置於冰上。
? 酶最後加入到反應體系中。
? 加入酶之前將反應混合物混勻，可以用移液槍上下吹打或輕彈管壁，然後在離心機中快速離心。切忌振蕩混勻。
? 一般情況下，我們推薦使用 5-10 單位酶量/μg DNA，基因組 DNA 用 10-20 單位酶量消化 1 小時。
? NEB 推出一系列的高保真（HFTM）內切酶，為建立酶切反應體系提供了更多便利。
? 如果使用 RE-Mix，請參考 2013﹒2014 商品目錄 276 頁的操作方法。
DNA
? 避免酚、氯仿、酒精、EDTA、變性劑或過多鹽離子的污染。推薦在純化過程中多清洗幾次。
? 甲基化的 DNA 會抑制某些酶的切割效率。
緩衝液
? 使用終濃度為 1X 的緩衝液。
? BSA 已被添加到 NEB 緩衝液 1.1、1.2、1.3 和 CutSmart 緩衝液中，無需額外添加 BSA。
? 在不需要 BSA 即可達到最佳活性的酶切反應中如果加入 BSA 也不會影響酶切效果。
反應體系
? 建議在 50 μl 反應體系中消化 1 μg 底物 DNA。
? 加 入內切酶的量應不超過總體積的 10%，以避免甘油過量引起的星號活性。
? 內切酶貯存液中的添加物（如：甘油和鹽）和底物溶液中尚存的殘餘物（如：鹽、EDTA 或乙醇）會導致小體積反應出現問題。下述為小體積反應技術指南。
酶切反應體系的選擇
* 當內切酶用量小時，用推薦稀釋液稀釋後使用。
**使用 10 μl 反應體系時，溫育時間不要超過 1 小時，以防蒸發。
溫育時間
? 標準體系溫育 1 小時，省時酶切體系溫育 5-15 分鐘。
? 使用省時內切酶。
? 許多內切酶都可以用更少單位的酶消化16小時。
終止反應
若消化後的 DNA 不需要進行後續實驗操作：
? 用終止液終止反應 [50% 甘油、50 mM EDTA（pH 8.0）和 0.05% 溴酚藍]（如 NEB #B7021）。按每 50 μl 反應體系中加入 10 μl 的比例進行。
若消化後的 DNA 需要進行後續實驗操作：
? 用 熱失活法（以確定該酶能否熱失活）。
? 若該酶不能熱失活，利用商業化的離心柱或酚/氯仿抽提去除內切酶。
貯存
? 大多數內切酶建議保存在 -20℃。只有少數內切酶若貯存時間超過30 天建議保存在 -70℃。
? 10X NEBuffer 也應保存在 -20℃。
穩定性
? NEB 每 4 個月都會對所有的內切酶進行活性檢測。使用期限標註在每管產品的標籤上。
? 在任何情況下，都應儘可能的避免將酶置於高於 -20℃ 的溫度下。
對照反應
如果在切割底物 DNA 時遇到了問題，建議加入以下對照實驗：
? 酶切對照 DNA（含有多個已知內切酶切割位點的 DNA，如 Lambda DNA 或腺病毒-2 DNA），以檢測內切 酶的活性。
? 如果對照 DNA 能夠被切割而實驗中的底物 DNA 不能，可以將這兩種 DNA 混合在一起再進行酶切，以檢測實驗用的底物 DNA 中是否存在抑制反應的物質。如果確實存在某種抑制因子（通常為鹽、EDTA 或酚），則混合之後對照 DNA 也不能被切割。
星號活性
? 當內切酶在非最適條件下使用時可能會產生星號活性。
? 可以通過以下方法降低星號活性：使用高保真（HF）內切酶、縮短溫育時間、使用省時內切酶或者增大反應體積
本期編輯：胚芽鞘 本文來源：生物秀論壇
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