基於第三代測序的16S rRNA基因測序

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簡介

第三代測序技術是指單分子測序技術。DNA測序時，不需要經過PCR擴增，實現了對每一條DNA分子的單獨測序。

原理

第三代測序技術原理主要分為兩大技術陣營:

第一大陣營是單分子熒光測序：當熒游標記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時候，它的熒光就同時能在DNA鏈上探測到。當它與DNA鏈形成化學鍵的時候，它的熒光基團就被DNA聚合酶切除，熒光消失。

第二大陣營為納米孔測序：新型納米孔測序法(nanopore sequencing)是採用電泳技術，由於納米孔的直徑非常細小，僅允許單個核酸聚合物通過，而ATCG單個鹼基的帶電性質不一樣，通過電信號的差異就能檢測出通過的鹼基類別，從而實現測序。

SMRT與微生物

被稱為第三代測序技術的單分子測序是最近幾年發展起來的高通量測序技術。其中，由 Pacbio?BioSciences公司開發的單分子實時測序技術（SMRT）是最先商用的技術。SMRT測序技術通過對模板序列循環測序產生環形一致序列（CCS），成功克服第三代測序技術準確率低的弊病。通過 SMRT測序技術，科學家可以更深入準確地探究複雜環境微生物的結構和功能。

SMRT在16S rRNA中的優勢

1、讀長覆蓋全長16S rRNA基因

基於16S rRNA基因的微生物多樣性的研究中測序部分高變區是目前最常用的方法。研究表明不同的高變區（V1-V9）對不同分類下的微生物解析度不同。研究表明，V1-V3 區域所包含的信息量最接近全長16S rRNA基因的信息量，但是，兩者依然存在較大的差別。因此，測序全長 16S rRNA基因序列是最理想的方法。

2、相對可靠度的16S rRNA基因序列

SMRT 測序技術中的測序錯誤以單鹼基的插入和缺失為主，而且呈現隨機分布的模型。因此，採用循環測序的方法對同一條 16S rRNA 基因模板多次測序，再通過多重比對方法獲取環形一致序列（Circular consensus sequence，CCS），這樣可以大幅減少測序引起的鹼基錯誤。

3、測序速度更快

SMRT 測序技術測序速度快，可以達到10bp/s，能夠縮短測序工作的周期。