藥物晶型及相關分析手段介紹

前言

1832年Woehler和Liebig發現苯甲醯胺化合物存在兩種不同的晶型，至此，國內外開始重視並研究藥物的不同晶型及其晶型差異，尤其在NCE的開發過程中。同一種藥物，由於結晶過程的差異(如溫度、壓力、溶劑)，可以生成完全不同類型的晶體，這種現象稱為藥物的多晶型現象，也稱「同質異晶」現象。多晶現象在有機藥物中是非常普遍的。同一個化合物含有2個或2個以上的晶格結構，形成多種晶型的現象稱為多晶型現象；與晶型相對應的則是無定型，即它的分子是無規則排列、沒有一定的晶格常數的形態(見下圖)。

對於固體藥物而言，不同晶型的同種藥物，其理化性質如穩定性、溶解性、吸濕性、形狀、顏色、流動性、密度等可能存在顯著差異，因此有時可能會在大批量生產或製劑過程中產生不同程度影響；更主要的是，不同質異晶有時會在生物利用度、藥效等方面可能會存在顯著區別，如服用相同劑量的阿司匹林，服用晶型II的血葯濃度高於晶型I的70%。因此，在進行藥物研究前弄清其晶型及相應的影響是非常有必要的。

X射線粉末衍射(XRPD)

1895年，倫琴發現了Ｘ射線；1912年勞厄、弗里德里希和克里平發現晶體的Ｘ射線衍射現象，揭示了Ｘ射線的本質和晶體的原子結構特徵，為晶體結構分析奠定了基礎。當一束單色X射線入射到晶體時，由於晶體是由原子規則排列成的晶胞組成，這些規則排列的原子間距離與入射X射線波長有相同數量級，故由不同原子散射的X射線相互干涉，在某些特殊方向上產生強X射線衍射，衍射線在空間分布的方位和強度，與晶體結構密切相關，這就是X射線衍射的基本原理。

XRD用於藥物研究方法一般是兩種方法：X射線單晶衍射法和X射線粉末衍射法。單晶法是研究和確認化學藥物多晶型中最基礎最可靠的方法，但單晶樣品難獲得(需要獲得大於0.1mm的單晶體)；XRPD一般可用於檢測化學藥物的純度、晶型穩定性、識別藥物製劑總原料葯含量、晶型變化等，樣品較易獲得，且圖譜一般具有較強專屬性。

我們一般獲得的XRPD是一個衍射強度I ~ 2θ衍射譜(如上圖為不同晶型乳糖的圖譜)，我們可以從衍射譜上獲取3個信息：衍射峰的位置、強度和形狀。每一個衍射譜都是一個晶型結構的指紋，可通過它與已知的圖譜進行比較從而判斷化合物的晶型。每一種晶型成分都能被掃描出其獨特的衍射圖譜譜線。衍射其實是一種散射現象，X射線按一定方向投射到晶體上，與晶體中電子發生作用，一部分X射線改變了方向，向四面八方散射，電子越多，散射能力越強，因此有了衍射強度I ~２θ衍射譜。一個晶體衍射譜上面的各種峰形是某些特殊原子在晶體面上的衍射，並不能給出它在分子化合物中的位置。因此，上圖無定形結構的乳糖反映出來的就是一個大的駝峰，即典型的無定形光暈。

在固體混合物中，每一種晶型都產生相互獨立的XRPD譜，因此混合物的XRPD譜就是各粉末衍射圖譜的累加。如果藥物與賦形劑的相互作用結果產生一種新的晶型，那麼，反映在混合物的XRPD譜中就會出現新的峰；如果藥物與賦形劑的相互作用結果產生無定型，那麼，反映在混合物的XRPD譜中就會出現駝峰。因此XRPD在藥物處方篩選方面可發揮一定的作用。XRPD是目前鑒別晶型的最主要的方法。

振動光譜(IR譜 & Roman譜)

振動光譜是指物質分子或原子基團的振動所產生的廣譜，分子的振動躍遷過程中會伴隨有轉動能級的變化，整個分子的振動光譜包含若干條譜帶。如果用的光源是紅外光譜範圍(0.78 - 1000um)，產生的即為紅外吸收光譜IR；如果用的是強單色光(如激光)，產生的即為激光拉曼光譜Raman。它們對固態表徵是一類非常有效的工具。Raman光譜源於分子極化率的變化，可以探測分子內化學鍵的伸縮和彎曲等典型振動；IR光譜檢測的則是分子振動時產生的偶極矩變化，對極性基團更為靈敏，兩種方法的結合更易於對分子結構的測定和研究。紅外光譜和拉曼光譜對有機化合物的結構、構象等比較敏感，因此這兩種技術手段是分析原料葯和輔料特徵的常用方法，也可對藥物晶型進行定量和定性分析。

晶態藥物中晶胞內部分子之間存在著較弱的相互作用力(如氫鍵、絡合鍵等)，使得不同晶型分子內共價鍵強度存在一定差異。IR光譜是根據分子內部原子間的相對振動和分子轉動時產生的偶極矩變化等信息來確定物質分子結構和鑒別化合物的分析方法，因此分子中必須含有對IR敏感的可伸縮的偶極子結構。不同晶型固體藥物的IR光譜的差別主要包括峰形變化、峰位偏移及峰強度改變等。如下圖為氯磺丙脲晶型I和晶型III的IR譜，在400 ~ 650 cm-1波段，晶型III在438 cm-1處有一個弱峰，而晶型I在534 cm-1處有一個強峰；晶型I與晶型III在483 cm-1處都有一個尖強峰，但晶型III在此處的尖峰分裂出一個肩峰，此外晶型III在630 cm-1處的尖強峰也分裂出一個肩峰。在950 ~ 1200 cm-1波段，晶型III在986、1015和1036 cm-1處三個分別有吸收相對強度都強於晶型I的尖峰；晶型III在1088 cm-1處的強峰分裂出一個1118 cm-1的強峰，而晶型I在1169 cm-1處的強峰也同樣分裂為兩個強峰。

由於氯磺丙脲I和III型分子的區別僅在於空間構型不同，而分子內化學鍵大都相同，因此我們可以看到上圖的IR譜中，它的兩種晶型IR譜中有很多重疊特徵峰，不利於區分晶型。IR光譜不僅能用於佐證化合物的結構，也能通過探測分子內化學鍵的振動而判斷化合物的晶型結構。

Raman譜是一種散射光譜，由印度科學家CV Raman於1928年發現，它能提供一些紅外吸收活性很弱或根本沒有紅外吸收活性的分子振動模式的信息；激光技術出現後，以激光為光源的拉曼散射技術被廣泛用於化合物結構分析的測試手段。強單色(如激光)中的光子與分子發生非彈性散射，使分子從低能態躍遷到高能態(斯托克斯線)或從高能態躍遷到低能態(反斯托克斯線)。Raman譜是基於分子振動能級的改變而產生的光譜，研究化合物分子受光照射後所產生的散射光與入射光能量差與化合物振動、轉動頻率間關係的分析方法，可以探測分子內化學鍵的伸縮和彎曲等典型振動，與IR譜相反，分子中對稱結構能被Raman譜檢測到，如下圖化合物鹽酸曲馬多拉的Raman譜：

鹽酸曲馬多拉分子中含有一個芳香環，芳香環有特別明顯的對稱伸縮頻率，是拉曼光譜上主要的特徵峰，其不飽和雙鍵的面外彎曲振動很強，而環的變形振動則較弱。芳香環中碳碳雙鍵在拉曼光譜中顯示出強的峰(993.82 cm-1)，其附近的碳氫伸縮頻率大；643.79 cm-1表現的為環面變形振動。鹽酸曲馬多拉還含有一個對稱結構環已烷，在2869 ~ 1936 cm-1有相對強的吸收峰。而最強的吸收峰則由芳香環上的C-H伸縮振動產生的。

Raman譜能檢測樣品的種類比較廣，檢測時採用的光源為激光，因此僅需一點樣品即可檢測，樣品覆蓋激光即可。可將拉曼光譜與紅外光譜結合分析，通過它們之間的互補關係，提供更為全面、準確的分子振動狀態和分子結構等方面的信息。

核磁共振NMR

核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)是1946年由美國斯坦福大學布洛赫(F.Block)和哈佛大學珀賽爾(E.M.Purcell)各自獨立發現的，兩人因此獲得1952年諾貝爾物理學獎。核磁共振主要是由原子核的自旋運動引起的，不同的原子核自旋運動的情況不同，NMR譜就是通過探測在不同磁場中不同原子核展現出來的不同頻率而產生的圖譜。目前已有很多的原子核的能檢測到NMR，其中C原子和H原子被研究得最多。NMR譜可用於固體樣本和液體樣本的研究，液體樣本通常用於化合物結構的確認，而對於固體樣本還能用於化合物晶型的確認，如下圖的羅西非班：

羅西非班結構中含有一個正丁基，晶型I中的正丁基對稱性差，因此三個亞甲基峰(63 & 66、31 & 32、19 & 21)和一個甲基峰(14 & 16)均出現分裂；而在晶型II中這四個峰未出現分裂現象：亞甲基峰(66、32、19)和甲基峰(16)。

化合物晶型結的不同，化合物分子結構中的原子所處化學環境存在細微差異，在外磁場的作用下可產生不同的響應，最終展現出不一樣的NMR圖譜。目前能通過這項技術檢測的除了有13C外，還有31P、15N、25Mg、23Na。因此，如果已知分子中某個原子核的共振情況，那麼樣品的晶態形式即可被確定。NMR樣品檢測不局限於單晶樣品，因此對於藥品的前期研究有很大幫助，而且它的檢測靈敏度很高、樣品需求量很少；但NMR圖譜獲得數據的時間相對較長，價格也一般較貴。

其它方法

在化合物晶型的確認過程中，除了採用上述介紹的幾種波譜法外，還有一些物理方法：

熔點測定法：由於多晶型晶格能差會使同質異晶體間存在熔點差異，故可用熔點測定法做定性鑒別，如區分尼莫地平的兩種晶型(晶型H：123 ~ 125 ℃；晶型L：112 ~ 114℃)。

溶解度與熱力學參數的關係：固體藥物不同的晶型呈現出不同的自由能，而晶體的溶解度大小和其自由能有關，自由能越大，溶解度越大。多數隨著溫度的升高，溶解度逐漸增大。阿昔洛韋的晶型區分可採用溶解度法。

電子顯微鏡法：包括透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEW)，其中在晶型研究方面，SEW用得更廣泛點。採用SEW，將圖像放大到一定倍數，可直接觀察到晶癖的形狀、晶面夾角等。鹽酸林可黴素的7個晶型具有不同的結晶形狀，在普通光學顯微鏡下即可區分出來。

差示掃描量熱法(DSC)：同質異晶體具有不同的自由能，因此在加熱過程中會發生不同的熔融、轉型、氧化還原、分解、升華以及脫水或脫溶劑等現象，亦可用於定量分析。如可採用DSC對鹽酸丁螺環酮的兩種晶型I、II進行定性定量區分。DSC測試過程中，對樣品的損害是不可逆的，因此對於不易獲得或貴重的樣品，在選擇DSC前需權衡一下利弊。

密度測定：不同晶型的藥物，因分子或原子在晶格空間排列不同，將導緻密度不同，因此可通過測定其比重、松狀密度、振實密度等進行晶型的確認。

後記

藥物晶型的測定方法多種多樣，並不局限於上述介紹的幾種方法；對於某些晶型體系而言，有時可能很難判斷哪種方法更好，因此需要選擇一個適合自己藥物晶型的方法，必要時可採用數種方法並用，從不同角度對晶型進行鑒別。許多化合物能形成溶劑化形式或水合形式，因此，需注意的是，藥物的多晶型主要指同一種化合物(同一個分子結構)呈現多晶型，如兩個非溶劑化晶型稱為多晶型，兩個一水化合物晶型稱為多晶型，而非溶劑化與一水合物不稱為多晶型。對於仿製葯的研究工作，首先要保證與RLD的物質基礎一致，晶型也應與之一致；如果該晶型存在知識產權問題或其它方面的原因較難一致，那麼在進行仿製葯研究過程中，應明確晶型的不一致會影響藥物的哪些特性(生物學還是物理學特性)，在此基礎上選擇合理的晶型。

主要參考文獻：

1. X射線粉末衍射法在藥物研究和質量控制中的應用；

2. 固體藥物晶型定量分析方法

3. 拉曼廣譜分析鹽酸曲馬多的結構特徵

4. Solid-state analysis of the active pharmaceutical ingredient in drug products

5. Solid-state carbon NMR characterization of the polymorphs of roxifiban.

6. Polymorphism and pseudopolymorphism: Influencing the dissolution properties of the guanine derivative acyclovir.

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