腫瘤治療的潛在靶點：線粒體活性氧

前 言

線粒體為細胞活動提供能量，同時也是線粒體活性氧（Mitochondrial ROS, mROS）的來源。研究發現，mROS具有促進腫瘤細胞發生、發展的作用，mROS和線粒體抗氧化系統互相作用，共同參與調控腫瘤細胞存活和惡性潛能進展的多種信號傳導網路。

2017年4月，《Seminars in cancer biology》雜誌發表綜述《Mitochondrial ROS control of cancer》詳細闡述了mROS和線粒體抗氧化系統在腫瘤細胞中的作用，並展望了未來的研究方向。筆者結合相關文獻，向大家做簡要介紹。

線粒體活性氧和抗氧化系統

大量的研究表明，線粒體是細胞信號傳導的主要參與者，其中部分功能是通過在生理和病理條件下產生和消除活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）來實現的。mROS是線粒體代謝的副產物，由氧化磷酸化和分子O2還原過程中的電子泄漏產生。

mROS包括超氧化物陰離子（O2·-），羥基自由基（·OH），過氧化氫（H2O2）和純態氧(O2·-)。線粒體電子傳遞鏈（Electron Transport Chain, ETC）複合物I和複合物Ⅱ之間的不完全電子轉移導致在線粒體基質中產生O2·-，而在ETC複合物Ⅲ上的電子泄漏導致在線粒體基質和線粒體膜間隙中產生O2·-。線粒體膜間隙中的O2·-更易泄漏到細胞質中，其可以對胞質中的DNA起到修飾作用。不同的ETC複合物在生理和病理狀態下產生mROS的能力不同。在大多數病理條件下複合物I是產生O2·-的主要部位；而不論在生理還是病理條件下，複合物Ⅲ都可以被缺氧信號通路和低氧誘導因子（HIF）激活產生O2·-。線粒體局部NADPH氧化酶4（NADPH-oxidase, Nox4）也產生以H2O2為主的mROS。Nox4與許多疾病的病理生理學有關，抑制Nox4可誘導間皮瘤細胞凋亡。線粒體外膜中的單胺氧化酶（monoaminoxidase, MAO）在心臟和大腦的缺血再灌注損傷中產生H2O2。如上所述，有多種途徑生成mROS對細胞的生理或病理狀態產生調節。

ROS產生和清除對於保持細胞健康是同等重要的，線粒體內不同的抗氧化系統共同保持氧化還原的平衡。抗氧化系統的受損可能導致氧化應激，促進多種疾病包括癌症的發生。

長期以來，腫瘤的惡性進程被認為與高水平的ROS導致的DNA損傷相關。同時，腫瘤的惡性進程也與線粒體中代謝活動由有氧氧化向糖酵解轉換（Warburg效應）有關。在此基礎上，越來越多的研究開始關注線粒體在腫瘤發生髮展過程中的新機制，如mROS的生成、氧化還原調節以及與腫瘤相關的凋亡信號傳導，試圖從mROS調節的角度解釋線粒體對腫瘤的影響。

mROS在正常生理調節中的作用

在生理條件下，mROS參與了多種信號網路的調節。H2O2介導的半胱氨酸氧化是mROS參與調節增殖和存活信號的主要形式。H2O2也可以通過不同的機制調節細胞增殖：如使抑癌作用的PTEN蛋白失活，激活細胞周期蛋白依賴性激酶1（Cdk1）抑制蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP1B）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸酶。除了細胞增殖外，mROS還能促進血管新生。mROS能促進血管內皮生長因子（VEGF）的轉錄，也能通過誘導HIF促進VEGF的表達，從而誘導血管新生。mROS誘導的HIF能與缺氧應答元件（HRE）結合，表達缺氧適應基因使細胞適應低氧水平。儘管以往認為高水平的ROS有害，但mROS對於維持正常的細胞功能至關重要。

腫瘤細胞中的mROS

長期以來，氧化應激或ROS的異常積累被認為與腫瘤有關。雖然ROS在腫瘤中具有促有絲分裂作用，但是更高水平的ROS同樣可以通過誘導腫瘤細胞凋亡或壞死，引起腫瘤細胞損傷。因此腫瘤細胞和健康細胞一樣，需要精細的氧化還原平衡以維持生存。由於腫瘤細胞需要利用ROS的有絲分裂作用來維持細胞的增殖，因此腫瘤細胞內存在多種機制以維持足夠的ROS水平。抑癌基因的缺失、致癌基因表達和線粒體DNA突變都受到ROS的調節，而這些又可以正反饋性的方式維持mROS的水平從而促進腫瘤進展。

抑癌基因可通過同時影響抗氧化反應和氧化反應來調節腫瘤細胞增殖、分化，促進凋亡和其他重要細胞活動。一些抑癌基因，包括p53、p21、p16、Foxo和乳腺癌易感基因1（BRCA1）和BRCA2都已經證實可通過mROS影響腫瘤細胞。例如，p53可以分別通過促進和限制ROS產生來誘導凋亡和減輕DNA損傷。FoxOs轉錄因子家族可控制抗氧化水平，並通過乙醯化、磷酸化和泛素化來調節ROS和mROS。FoxOs可促進化療時腫瘤細胞的凋亡，也可以誘導腫瘤細胞靜止。另外，SIRT3已被證實可通過減少ROS產生和HIF-1α的激活來抑制結腸癌細胞系。

癌基因的表達也影響mROS的產生和腫瘤的增殖。例如，致癌基因Ras和Myc增加線粒體和其他細胞器中氧化物的生成，促進腫瘤生成和遷移。致癌基因通過ROS生成誘導的mDNA突變和線粒體功能障礙，進一步增強ROS水平和正常細胞凋亡。在肺癌的小鼠模型中，Kras主要通過錨定線粒體複合物Ⅲ和複合物I產生腫瘤細胞生長需要的ROS。

在腫瘤細胞中，ROS介導的其他途徑包括激酶的激活，磷酸酶的抑制以及磷蛋白和蛋白酶的調節。腫瘤細胞和正常細胞通過一些相同的信號通路促進細胞增殖。例如，mROS在缺氧期間通過誘導的HIF-1α穩定促進血管生成的機制也有利於腫瘤細胞的生長和增殖，對機體產生有害作用。HIF-1α與幾種類型的癌症侵襲有關。基質金屬蛋白酶（MMPs）是一組水解細胞外基質（ECM）成分的內肽酶，也被證實可促進腫瘤進展。mROS通過調節MMPs和HIF-1α在腫瘤轉移中發揮關鍵作用，這可能是由線粒體內氧化還原依賴程序調控的。

健康細胞和腫瘤細胞中的氧化還原平衡

線粒體抗氧化系統

ROS形成和清除的精確調節對於維持細胞和有機體內穩態至關重要。細胞內有幾種酶促和非酶促反應把高反應性分子轉化為相對低反應性分子。細胞中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶和過氧化氫酶在不同的部位參與這些過程。例如，反應性O2-通過細胞質中的SOD1、線粒體基質中的SOD2和細胞外空間中的SOD3轉化為H2O2。過氧化氫酶和過氧化物酶體系，如硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶/過氧氧化還原酶（Trx / TrxR / Prx）以及谷胱甘肽/谷胱甘肽過氧化物酶（GSH / GPx）系統通過芬頓反應將H2O2還原成H2O。這些氧化還原系統既互相獨立又互相作用：線粒體中Trx2 / TrxR2 / Prx3系統與細胞質、細胞核的Trx1 / TrxR1 / Prx系統互相獨立；而線粒體內的GSH必須與細胞質的GSH系統相互作用才產生作用。

ROS清除系統的作用如下：

1、SOD2 / MnSOD2

錳超氧化物歧化酶（SOD2）是催化O2-轉化為H2O2的線粒體抗氧化酶。SOD2主要通過改變氧化還原狀態調控轉錄因子NF-κB，HIF-1，AP-1和p53而影響細胞增殖、轉化、遷移、侵襲和血管生成。高SOD2表達可以直接抑制細胞增殖或增加腫瘤細胞對抗癌藥物細胞毒性的敏感性。相反，SOD產生的H2O2通過增加snail、MMP1、和磷酸化ERK1/2蛋白水平以及抑制E-鈣粘蛋白（E-cadherin）增強舌鱗狀細胞癌細胞的惡性程度。SOD2也通過促進乳腺癌細胞的上皮間質轉化（EMT）促進腫瘤遷移。腫瘤細胞中SOD2的表達增加也可能導致了抗失巢凋亡，延長了腫瘤細胞的存活。SOD2在腫瘤發生過程中具有雙相作用：在腫瘤進展的初期階段，SOD2具有抑制腫瘤的作用，隨著腫瘤的發展，SOD2可能會促進腫瘤轉移。

在最近的一項薈萃分析中，通過分析SOD2多態性與非霍奇金淋巴瘤、肺癌和結直腸癌發展之間的關係，表明SOD2可以作為一項腫瘤生物標誌物。此外，SOD2 /過氧化氫酶和SOD2/ GPx1比例最近被提出作為腫瘤進展和轉移的生物標誌物。考慮到SOD2在不同類型和不同階段腫瘤中的不同作用，將SOD2作為治療靶點前須認真評估。

2、Grx2

Glutaredoxin-2（Grx2）是調節硫醇/二硫鍵氧化還原穩態的線粒體抗氧化系統。Grx2系統在HeLa細胞中通過保護Trx2/1免於氧化而影響抗凋亡信號通路。Grx2也與胚胎細胞中血管生成的調節有關，在腫瘤細胞中可能具有相似的功能。沉默Grx2可以使HeLa細胞對抗腫瘤藥物更加敏感。Grx2系統在幾種腫瘤細胞模型中通過調節硫醇氧化還原發揮抗凋亡功能。

3、GPx-1和GPx-4

谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）是代謝H2O2的一組線粒體同工酶，以還原型谷胱甘肽（GSH）作為輔因子。GPx-1和GPx-4都是硒蛋白，以硒代半胱氨酸作為關鍵活性位點。GPx-1過表達抑制細胞內ROS，通過調節氧化應激抑制生長因子受體，從而抑制細胞增殖。染色體3P上Gpx1基因缺失的突變與許多部位的腫瘤包括肺癌、頭頸癌、乳房和結腸癌的早期發生普遍相關。GPx4的3 UTR單核苷酸多態性與結直腸癌的風險增加有關。在正常細胞中，GPx4可以預防細胞壞死；在腫瘤細胞中，GPx4的過表達抑制纖維肉瘤和胰腺癌細胞的生長，而對黑素瘤細胞生長沒有影響。與其他抗氧化系統類似，與GPx相關的機制及其對腫瘤的影響尚不完全清楚。

4、硫氧還蛋白系統

硫氧還蛋白（Trx）系統是一個NADPH依賴性二硫化物還原酶系統，包括線粒體硫氧還蛋白（Trx2）、硫氧還蛋白還原酶（TrxR2）和過氧化物氧還蛋白（Prx3）。Trx / TrxR系統通過調節半胱氨酸巰基-二硫鍵交換反應控制細胞生長、增殖和其他細胞特性。

除了在線粒體氧化還原穩態中起關鍵作用，Trx2還通過NF-Kβ和ASK-1途徑調節氧化還原相關的轉錄和信號傳導因子，抑制細胞凋亡。在HeLa細胞中，Trx2可以降低TNFα介導的mROS增多和細胞凋亡，抑制下游的信號通路。

TrxRs是一組硒蛋白，對維持細胞氧化還原平衡十分重要。TrxR2是TrxR的線粒體同工酶。TrxR2催化Trx2的NADPH依賴性還原，抑制線粒體內ROS的升高，在肝癌中高表達。TrxR1是在細胞質的同工酶，在乳腺，甲狀腺，前列腺，肝臟，和結直腸細胞等部位的腫瘤中高表達。TrxR和Trx的高表達通過HIF-1途徑與腫瘤侵襲性有關。TrxRs水平升高是由腫瘤細胞代謝活性升高導致的ROS生成增加引起的。TrxRs已經成為腫瘤治療中的重要分子靶點，抑制TrxRs可使腫瘤細胞對細胞毒性藥物的敏感性增加。TrxR1和TrxR2中的單核苷酸多態性（SNP）與結直腸腫瘤的發生相關。

過氧化物氧還蛋白是一組過氧化物酶，其通過保守的半胱氨酸殘基消除過氧化物。在6種哺乳動物異構體中，Prx3和Prx5定位在線粒體。Trx2 / TrxR2 / Prx3軸的成員Prx3是線粒體基質中產生的H2O2的主要關鍵蛋白，抑制Prx3可導致細胞凋亡。Prx3在前列腺癌、結腸癌和宮頸癌中表達上調。研究表明，Prx3在抗雄激素治療抵抗性前列腺腫瘤細胞中調控ROS誘導的細胞凋亡，可作為前列腺癌的治療靶點。在惡性間皮瘤細胞系中，研究發現Prx3調節mROS水平升高能促進腫瘤細胞分裂， Prx3功能受損可使細胞周期停滯在G2/M期。

腫瘤細胞的線粒體抗氧化系統

針對mROS和抗氧化系統的抗腫瘤治療

目前，針對線粒體氧化還原活性的治療方法仍在進一步完善過程中。ROS可能抑制或者促進腫瘤增殖，儘管腫瘤細胞中ROS增多，但是由於抗氧化還原體系的存在，腫瘤細胞內高ROS的水平不會導致細胞死亡。在膳食中加入抗氧化劑的研究結果也不一致，可能與其僅全身性作用於mROS有關。補充類胡蘿蔔素可能會增加乳腺癌患者的死亡率，補充維生素C和E可能降低乳腺癌複發率。維生素C增強了多柔比星在乳腺癌中的抗增殖作用，維生素D可能增加結直腸癌患者的生存率。

既然靶向抑制mROS可以抑制腫瘤，那麼增強線粒體中天然抗氧化機制的活性會不會產生相同的結果呢？然而研究發現TrxR，特別是線粒體TrxR2，在多種腫瘤細胞中高表達，並且與腫瘤的侵襲有關。同時Grx2也被證明在腫瘤細胞中具有抗凋亡作用。鼠乳腺癌中谷胱甘肽水平的降低不會抑制腫瘤發展，而是通過增加Trx活性來補償ROS水平的改變，可見腫瘤細胞可通過增強線粒體的抗氧化功能適應谷胱甘肽抑制以更好的存活。靶向抑制Trx2可通過限制蛋白酶體功能、促進細胞毒性氧化應激來抑制多發性骨髓瘤生長；下調Grx2可以使細胞對化療的細胞毒作用敏感。

抗氧化劑是通過ROS，在腫瘤的發生、發展和轉移中發揮作用；而促氧化劑同樣是通過ROS，發揮促進腫瘤凋亡、逆轉腫瘤細胞對化療和放療的抵抗性的。這種矛盾的解釋引起了對ROS和抗氧化治療腫瘤機制的關注，治療的有效性似乎取決於腫瘤細胞的特定狀態，特別是細胞基礎的氧化應激狀態。有些研究者提出了「氧化還原信號特徵」，用細胞的氧化還原狀態、抗氧化劑的表達水平、細胞信號傳導和轉錄因子激活譜作為確定抗氧化劑或促氧化劑治療在治療特定類型的癌症中是否有效的參考。因為細胞的氧化還原狀態是經常變化的，所以試圖通過這種量化方法衡量氧化還原狀態並選擇治療需慎重。

總之，不論是抑制腫瘤細胞生長還是誘導腫瘤凋亡，抗氧化治療和促氧化治療均能起到抑制腫瘤的作用。因此，在確定是否服用促氧化劑或抗氧化劑進行腫瘤治療時，明確特定個體「氧化還原信號特徵」可能是關鍵的決定因素。

「論腫道麻」點評

由於分子氧和營養的相對缺乏，腫瘤細胞的線粒體代謝與正常細胞不同。線粒體作為生成和消耗H2O2主要的細胞器，在調節細胞內ROS水平中起著重要的作用，也是調節細胞氧化還原水平的重要靶點。線粒體是一種動態細胞器，具有雙重作用的原因可能是為了協調對氧化還原敏感的信號通路。在氧化還原失衡時，不論這種失衡是促進腫瘤還是抑制腫瘤，細胞和線粒體都會適應性地觸發保護性機制來維持細胞的存活和功能，其中也包括腫瘤細胞。因此，未來針對線粒體的治療可能是限制細胞對mROS和ROS信號的整體反應程度，隨著新型的腫瘤細胞線粒體靶向策略的出現，基於抗氧化劑的化學治療在腫瘤治療中的價值和地位尚需進一步探討。

（編譯 吳啟超 審校 繆長虹）

原始文獻

1、Idelchik MDPS, Begley U, Begley TJ, Melendez JA. Mitochondrial ROS control of cancer. Semin Cancer Biol.2017 Apr [Epub ahead of print]

2、Chio I, Tuveson D A. ROS in Cancer: The Burning Question [J]. Trends Mol Med, 2017,23(5):411-429.

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