冷凍電鏡新晉諾獎，想進一步了解就來看這個專題

生物探索

編者按

前幾日剛剛公布的2017年諾貝爾獎化學獎，頒給了三位開發冷凍電鏡技術的科學家。近幾年，冷凍電鏡在結構生物學領域帶來了革命性的變化，對生物大分子複合物結構分析的精度和範圍都超越了以前的傳統方法。

今天，探索君就在此給大家介紹一下冷凍電鏡是如何被開發出來的，其發展歷程上的里程碑事件以及冷凍電鏡在中國的發展，並盤點一下這兩年中國科學家在該領域發表在CNS上的研究文章。

1

冷凍電鏡的開發

這屆諾貝爾獎化學獎頒給了Jacques Dubochet, Joachim Frank 和Richard Henderson。3人因開發冷凍電鏡技術而獲獎，他們簡化和提高了生物分子的成像，可以說，將生物化學學科帶入新紀元。

2017年諾貝爾化學獎獲得者圖片 來源Nobel官網

1975年，Richard Henderson和同事用電子顯微鏡獲得了歷史上第一張膜蛋白——細菌視紫紅質的三維結構圖。15年後，Henderson再次對外發布了解析度達到原子層面的細菌視紫紅質立體圖像，這一突破性成果有力證明了用電子顯微鏡進行生物分子成像的潛力。

在1975到1986年間，Joachim Frank研發了一種圖像處理方法，可以對電子顯微鏡下模糊的2D圖像進行分析和合併，從而顯示出一個清晰的三維結構。

Frank的成像分析方法圖片 來源Nobel官網

而Jacques Dubochet的工作集中在「冷凍」這個詞上，他成功實現了將蛋白樣品固定在玻璃態的冰中，使得在電子顯微鏡的高真空環境觀察接近生理狀態下的蛋白成為可能。

Dubochet的玻璃化方法 圖片來源Nobel官網

「冷凍電鏡技術（cryo-electronmicroscopy, cryo-EM）」能夠對含水的粒子（hydrated particles）進行直接成像。除了具有這些優勢之外，冷凍電鏡還能夠減少電子束對樣品產生的放射性損害。這種技術不僅能夠研究生物大分子在晶體狀態和溶液狀態的結構，且能夠研究複雜大分子體系和超分子體系，如核糖體、病毒、溶酶體和線粒體等。

冷凍電子顯微鏡工作示意圖 來源Nature

2

冷凍電鏡技術發展里程碑

冷凍電鏡之前的問題就是得到的照片信噪比比較低。在最新的電子探測器出現之前，人們使用電荷耦合器件（CCD），電子照下來要先打在熒光層上變成光信號，然後CCD轉換成電信號產生圖像，多餘一次的光轉換降低了效率。

與顯微鏡生產商合作時，研究者們發明了一種新的直接電子探測器，這種探測器的靈敏度遠高於膠片和CCD。最新的技術能夠直接把電子抓下來，很多以前不起作用的演算法都能用了，看不見的蛋白質可以找到了。大約在2012年，這種探測器能夠以一分鐘幾十幀的高速得到單個分子原子的連續圖像。X-射線晶體衍射只能對單個、靜態的蛋白晶體成像，但冷凍電子顯微鏡能夠對蛋白的多種構象進行成像，幫助科學家們推斷蛋白的功能。

圖中黑點是2000-2012年cryo-EM解出的結構。紅點都是2013年cryo-EM突破以後的結構。圖片來自Bai, X.-c., McMullan, G. andScheres, S. H. W. (2014) How cryo-EM is revolutionizing structural biology.Trends Biochem. Sci.

通俗地來說技術突破是：

1. 直接電子探測器。和CCD相比基本就是單反和卡片機的區別。

2. 隨之而來的演算法。高速的記錄能力使得之前只能記錄一張照片，現在能記錄幾十幀的影片。這麼說吧，以前是在用美圖秀秀，現在在用繪聲繪影。

結果，是解析度的大規模提升。以前只能看清楚個人影，現在能看清楚臉上的雀斑。

因為冷凍電子顯微鏡技術的出現，我們能看到的微觀世界從圖片左側的樣子，變成了右側這樣。圖片來源Nobel官網

冷凍電鏡得到了迅猛發展，專家們正在尋找更大的挑戰作為下一個解析目標。對很多人來說，最想解析的是夾在細胞膜內的蛋白。這些蛋白是細胞信號通路中的關鍵分子，也是比較熱門的藥物靶標。但這些蛋白很難結晶，傳統的X射線晶體學方法就沒有辦法對膜蛋白進行解析。

冷凍電鏡新技術運用在膜蛋白上的里程碑是：2013年12月5日華人學者程亦凡與David Julius利用冷凍電鏡以近原子解析度3.4埃確定了TRPV1膜蛋白（檢測辣椒中引起灼燒感的物質的受體，並與其它痛感蛋白緊密相關）的結構，這促使許多結構生物學專家和製藥公司關注這一技術。

YifanCheng(程亦凡) 圖片來源UCSF

3

冷凍電鏡在中國的發展

1950年，錢臨照教授發現國民政府遺留物資里有一個裝滿透射電子顯微鏡 (TEM)部件的集裝箱立即就決定儘管缺少安裝手冊，也要組裝這些顯微鏡。此後在短短不到4年時間裡，錢臨照教授等人發表了中國大陸第一篇電子顯微學方面的論文，這篇論文也開創了中國利用電子顯微鏡探索納米世界的新時代。

這段時間許多材料科學與物理學的先驅科學家為發展國內電子顯微鏡事業做出了極大的貢獻，如錢臨照、郭可信、李方華、馮端和王仁卉等。如今國內冷凍電子顯微鏡領域超過三分之二的科學家都曾是這些科學先驅們的門生，或受他們的影響。

中國電鏡學者家譜圖 圖片來源Hong-WeiWang, Jianlin Lei, and Yigong Shi (2017) Biological cryo-electron microscopy in China. Protein Sci

中國冷凍電鏡分布圖圖片來源 Hong-WeiWang, Jianlin Lei, and Yigong Shi (2017) Biological cryo-electron microscopy in China. Protein Sci

4

中國科學家近期CNS研究成果

清華施一公團隊CNS連載剪接體的故事

The 3.8 ? structure of the U4/U6.U5 tri-snRNP: Insights into spliceosome assembly and catalysis

2016年1月29日，清華大學生命學院施一公院士研究組在《科學》（Science）上報道了釀酒酵母剪接體組裝過程中的一個關鍵複合物U4/U6.U5 tri-snRNP（剪接體組裝過程中最大也是最保守的預組裝複合物）高達3.8埃解析度的冷凍電鏡結構，並在此基礎上分析了剪接體的組裝機制，為進一步理解剪接體的激活及前體信使RNA（pre-mRNA）剪接反應的催化機制提供了重要分子基礎。

Structure of a yeast catalytic step I spliceosome at 3.4 ?resolution

2016年8月26日施一公院士課題組再度在剪接體研究中取得重大突破，2篇姊妹研究論文同期發表在《科學》（Science）雜誌。

研究小組採用冷凍電子顯微鏡獲得了平均解析度為3.4埃的釀酒酵母催化第一階段剪接體（複合物C）的原子結構。研究揭示的結構特徵描述出了第一階段催化反應後剪接體的形成，預測了完成第二階段酯轉移反應所需的結構改變。

Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 ? resolution

研究人員採用冷凍電子顯微鏡確定了來自釀酒酵母的催化激活剪接體（複合物Bact）的原子結構，平均解析度達到3.52埃。這兩篇背靠背的文章首次完整地展示了第一步轉酯反應前後pre-mRNA和其中起催化作用的snRNA的反應狀態，以及剪接體內部蛋白組分的組裝情況。

Structure of a yeast step II catalytically activated spliceosome

在2017年1月13日發表的《科學》長文中，施一公教授研究組捕獲了性質良好的釀酒酵母剪接體樣品，並利用先進的單顆粒冷凍電鏡技術和高效的數據分類方法，重構出了總體解析度分別為4.0埃的冷凍電鏡結構，首次報道了酵母第二步催化激活狀態下的剪接體結構。

2015年8月至今，施一公研究組共報道了剪接反應中5個關鍵狀態剪接體複合物的高解析度結構，基本覆蓋了整個剪接通路中關鍵的催化步驟，提供了迄今為止最為清晰的剪接體不同工作狀態下的結構信息，大大推動了RNA剪接研究領域的發展。這些結構與之前報道的系列結構組合在一起，組成了一個幾近完整的剪接體循環的分子機制拼圖，講述了剪接體的一個完整故事。

An Atomic Structure of the Human Spliceosome

2017年5月18日，清華大學施一公研究組於《細胞》（Cell）上發表第一個高解析度的人源剪接體結構，也是首次在近原子解析度的尺度上觀察到酵母以外的、來自高等生物的剪接體的結構，進一步揭示了剪接體的組裝和工作機理，為理解高等生物的RNA剪接過程提供了重要基礎。

顏寧團隊聚焦解析通道蛋白、轉運蛋白結構

Structural Insights into the Niemann-Pick C1 (NPC1)-Mediated Cholesterol Transfer and Ebola Infection

2016年6月2日，清華大學顏寧課題組與中國疾控中心、中科院微生物組高福院士課題組合作的一項最新成果，在世界上首次解析出NPC1蛋白的清晰結構，並初步揭示了它的工作過程，從而為干預、治療罕見遺傳疾病「尼曼—皮克病」和埃博拉病毒打開了新大門。

Structure of the voltage-gated calcium channel Cav1.1 at 3.6?? resolution

2016年9月8日顏寧團隊發表於Nature的研究文章在3.6??的解析度上，解析了兔Cav1.1複合物的冷凍電子顯微鏡結構，為興奮-收縮偶聯的機制理解，奠定了基礎，並為Cav和Nav通道的功能和疾病機制的分子解釋，提供了一個三維的模板。

Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2

RyR是廣泛存在於肌肉細胞及腦組織中的鈣離子釋放通道。在哺乳動物中，RyR有三個亞型，其中RyR1和RyR2分別在骨骼肌和心肌的興奮-收縮偶聯中發揮作用。2016年12月2日， Science雜誌上發表了清華大學醫學院顏寧研究組與加拿大卡爾加里大學陳穗榮研究組合作的研究論文揭示了目前已知分子量最大的離子通道Ryanodine受體RyR2亞型處於關閉和開放兩種狀態的三維電鏡結構，探討了RyR2的門控機制。

Structure of a eukaryotic voltage-gated sodium channel at near-atomic resolution

鈉通道是所有動物中電信號的主要啟動鍵，也是諸多國際製藥公司的研究靶點，有著巨大的製藥前景。2017年3月3日，清華大學顏寧研究組在世界上首次報道了真核生物電壓門控鈉離子通道的3.8 ?解析度的冷凍電鏡結構，為理解其作用機制和相關疾病致病機理奠定了基礎。

Structure of the Human Lipid Exporter ABCA1

2017年6月15日，清華大學生命學院顏寧研究組在Cell雜誌發表的一項新成果，首次報道了膽固醇逆向運輸過程中的關鍵蛋白ABCA1近原子解析度的冷凍電鏡結構，為理解其作用機制及相關疾病致病機理提供了重要信息。

似乎「冷凍電鏡+清華大學=CNS」

The architecture of the mammalian respirasome

清華大學生命科學學院楊茂君教授研究組在2016年9月29日的《自然》（Nature）期刊發表研究長文（Article），首次報道了迄今為止解析度最高的線粒體呼吸鏈超級複合物—呼吸體的冷凍電鏡三維結構。這一目前為止世界上所解析的最大也是最複雜的膜蛋白超級複合物結構，為我們深入理解哺乳動物呼吸鏈複合物的組織形式、分子機理以及治療細胞呼吸相關的疾病提供了重要的信息。

Structure of Mammalian Respiratory SupercomplexI1III2IV1

2016年12月1日，清華大學生命科學學院楊茂君研究組在《細胞》（Cell）報道了線粒體呼吸鏈超級複合物（呼吸體）原子解析度的冷凍電鏡三維結構。他們成功地將呼吸體結構的解析度提升至原子解析度（3.3-3.9 ?）級別，並解析了目前為止解析度最高的哺乳動物呼吸鏈複合物I的精細結構（3.3-3.6 ?）。

Structure of a Pancreatic ATP-Sensitive Potassium Channel

ATP敏感性鉀通道( ATP-Sensitive Potassium Channel，KATP通道)是受細胞內ATP濃度調控的一種內向整流鉀通道。KATP的突變會導致很多遺傳性代謝疾病。2017年1月12日，北京大學分子醫學研究所、北京大學-清華大學生命科學聯合中心研究員陳雷研究組與清華大學生命科學學院高寧研究組合作，在《細胞》（Cell）雜誌解析了ATP敏感的鉀離子通道（KATP）的中等解析度（5.6?）冷凍電鏡結構，揭示了KATP組裝模式，為進一步研究其工作機制提供了結構模型。

Structure of a eukaryotic cyclic-nucleotide-gated channel

脊椎動物的視覺和嗅覺很大程度上與一類稱為CNG離子通道的膜蛋白複合物有關，這類分子可以將光或者氣味信號轉變為生物電信號。2017年2月2日，清華大學生命中心李雪明研究組與哥倫比亞大學和昆明動物所的楊建研究組合作在《Nature》雜誌發表研究論文，該工作通過原子解析度冷凍電鏡技術首次揭示了秀麗線蟲的環核苷酸門控離子通道（cyclic-nucleotide-gated channel, CNG)TAX-4的全長結構。該工作首次解釋了為什麼CNG通道雖然具有電壓門控離子通道的諸多特徵但是不受膜電壓調控的結構機理。

備註 本文部分內容參考果殼、知乎、澎湃新聞和生物通。

End

本文系生物探索原創，歡迎個人轉發分享。其他任何媒體、網站如需轉載，須在正文前註明來源生物探索。

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！

本站內容充實豐富，博大精深，小編精選每日熱門資訊，隨時更新，點擊「搶先收到最新資訊」瀏覽吧！

請您繼續閱讀更多來自 生物探索 的精彩文章: