2017Cell：全新表觀程序抑制PD-1阻斷介導的T細胞復活
編者按：喜大奔普，國慶中秋長假結束之後我們的JC恢復正常了。10月13日中午Grabeel講解了一篇題為「De Novo Epigenetic Programs Inhibit PD-1 Blockade-Mediated T Cell Rejuvenation」的Cell文章。這也是Grabeel第二次做JC報告，主題依然是當前紅透半邊天的腫瘤免疫。以下為Grabeel提供的內容簡介與點評，同時也配發三位參與JC老師或同學的評論。
這項研究來自田納西孟菲斯的St. Jude兒童研究醫院Ben Youngblood教授課題組。
摘要：
主要結果：
1、效應期後的DNA重新甲基化伴隨著T細胞的耗竭
研究人員對WT和Dnmt3a cKO的實驗小鼠進行了LCMV病毒感染，從第8天開始到第60天期間對抗原特異性的CD8 T細胞進行了表型和功能分析，結果發現WT組相對於Dnmt3a cKO組隨著時間的推移其血清中病毒的滴度並沒有差異，但WT組的抗原特異性CD8 T細胞顯著低於Dnmt3a cKO組，並且WT組的抗原特異性CD8 T細胞分泌效應性細胞因子的能力嚴重受損。通過全基因組DNA甲基化測序，研究人員發現WT組小鼠的抗原特異性CD8 T細胞的效應相關區域的甲基化程度顯著增高（Day8vs.Day35），表明T細胞效應期後的重新甲基化伴隨著T細胞的耗竭。
2、慢性的T細胞刺激誘導了效應期後的重新甲基化程序
前一部分的研究證明了T細胞在耗竭過程中持續獲得了重新甲基化程序，並且特異性的差異甲基化區域（DMRs）是耗竭T細胞的表觀遺傳特徵，但是否這些重新甲基化程序的獲得是由於長期的病毒感染刺激仍然不得而知，為此研究人員在之前WT和Dnmt3a cKO實驗組的基礎上加入了急性病毒感染的實驗組，並對照這些實驗組的抗原特異性CD8 T細胞的表型和耗竭相關的DMRs進行了分析，結果發現急性病毒感染實驗組和Dnmt3a cKO實驗組的抗原特異性CD8 T細胞都具有分泌特定效應細胞因子的能力，並且IFNγ和CCR7位點的DMRs在急性病毒感染的情況下並沒有被重新甲基化，而隨著時間的推移進入慢性感染期後，DMRs被重新甲基化，以上實驗結果表明效應期後重新甲基化程序的獲得是由於慢性病毒感染的刺激所導致的結果。
3、CD8 T細胞內在的重新甲基化程序調控了耗竭
由於Dnmt3a cKO後CD8 T細胞的效應能力得到了恢復和增強，但是我們不清楚這種變化是否是由於細胞內源性DNA甲基化程序的變化而不是外源因子的作用，為此研究人員將轉基因P14細胞（對於gp33表位有特異性的轉基因CD8 T細胞）導入T細胞缺失Rag1 KO小鼠中，並對WT和Dnmt3a cKO P14CD8 T細胞進行了表型、功能以及位點特異性DNA甲基化狀態的分析，結果發現Dnmt3a cKO P14 CD8 T細胞相對於WT P14 CD8 T細胞具有更強的效應能力（數量、分泌細胞因子的能力以及增殖能力），並且WT組相對於cKO組其DMRs在持續抗原暴露的狀態下被重新甲基化，以上的實驗結果表明Dnmt3a cKO後CD8 T細胞的效應能力的恢復和增強是細胞內源性的，並且Dnmt3a介導的DNA甲基化程序對於T細胞耗竭的調控是十分關鍵的。
4、PD-1阻斷治療並沒有消除耗竭相關的DNA甲基化程序
從以上的研究結果中我們可以得到CD8 T細胞的重新甲基化在T細胞耗竭的過程中扮演了重要角色，這促使我們思考ICB介導的T細胞活性恢復是否導致了這些甲基化的抹除，為此研究人員對WT組小鼠進行了anti-PD-L1處理（屬於ICB），分離了恢復活性的T細胞並對耗竭相關的DMRs的甲基化狀態進行了分析，結果發現ICB處理並沒有影響重新甲基化程序，說明ICB治療並沒有通過消除重新甲基化程序來實現T細胞的活性恢復。
5、重新甲基化程序的抑制和PD-1阻斷協同增強了CD8 T細胞的活性恢復
由於Dnmt3a的條件性敲除和PD-1阻斷（ICB）都具有促使T細胞活性恢復的功能，但我們對這兩者的關係還不是很清楚，為此研究人員對WT和Dnmt3a cKO的實驗小鼠均進行了anti-PD-L1處理，對抗原特異性CD8 T細胞進行了分析。結果發現anti-PD-L1處理和Dnmt3a的條件性敲除的共同進行對耗竭T細胞的活性恢復效果超越了其他處理組（只進行anti-PD-L1處理、Dnmt3a的條件性敲除以及沒有進行處理），說明重新甲基化程序的抑制和PD-1阻斷（ICB）能夠協同增強耗竭CD8 T細胞的活性恢復。
6、在提高耗竭CD8 T細胞恢復活性的潛能方面DNA去甲基化藥物的治療能夠先於PD-1阻斷治療
之前的研究工作證明了重新甲基化程序造成了T細胞耗竭的出現和發展並且對PD-1阻斷處理並不敏感，這促使我們思考DNA去甲基化藥物的使用在提高耗竭T細胞的活性恢復方面是否能夠先於PD-1阻斷治療，為此研究選用了DNA去甲基化藥物地西他濱並先於anti-PD-L1處理WT小鼠並對CD8 T細胞的表型和功能進行了分析，結果發現先進行DAC處理並在這之後進行anti-PD-L1處理的實驗組的抗原特異性T細胞的數量以及增殖能力都有了顯著的提高，說明DAC處理可能與PD-1阻斷協同作用增強耗竭T細胞的活性恢復能力。
7、腫瘤浸潤性CD8 T細胞獲得了耗竭相關的重新甲基化程序
研究人員利用TRAMP-C2細胞進行致瘤，持續觀察腫瘤的生長，並對分選的腫瘤浸潤性CD8 T細胞（TILs）進行表型分析和位點特異性的甲基化分析，對TILs的表型分析發現TILs表現出了持續抗原暴露的特徵，包括PD-1和Tim-3的共表達，位點特異性（Tcf7、Ccr7、Myc、IFNγ）的甲基化分析發現PDhi Tim-3的腫瘤浸潤性CD8 T細胞在特定位點被高度甲基化，這些結果說明腫瘤浸潤性CD8 T細胞獲得了與耗竭相關的重新甲基化程序。
鑒於先前的研究顯示TRAMP-C2細胞對單純的PD-1/PD-L1阻斷不敏感，研究人員分析了DAC治療是否能夠提高CD8 TILs活性恢復的能力，結果發現DAC治療確實能夠增強CD8 TILs的增殖能力，並使得腫瘤的大小出現了下降，以上的實驗結果說明DNA去甲基化藥物的確能夠優於常規的ICB治療，在提高抗腫瘤T細胞活性恢復方面具有重要作用。
最後，作者提出了一個工作模型：
Grabeel的評論：
本文亮點：
免疫檢查點阻斷（ICB）介導的耗竭T細胞活性恢復讓疾病的免疫療法獲得人們廣泛的關注，ICB成為了治療各種腫瘤和慢性感染性疾病的一種有效和具有廣泛應用前景的生物醫學療法，但研究人員發現長期的抗原暴露所導致的T細胞耗竭是ICB療法所無法解決的問題，而本篇文章中研究人員發現在慢性的病毒感染過程中阻斷CD8 T細胞中的重新甲基化程序能夠使得耗竭的CD8 T細胞恢復活性，並且這樣的阻斷對腫瘤浸潤性CD8 T細胞（TILs）依然有效，本文發現的一種全新的提高耗竭T細胞活性恢復能力的方法使得對ICB療法效果不理想的病毒感染和腫瘤的有了新的治療手段，並且也能夠與ICB療法協同作用大大提高疾病免疫治療的效果，也為腫瘤和慢性感染性疾病的免疫治療提供了全新的思路。
局限性：
1、雖然抑制活化CD8 T細胞的效應期後的重新甲基化程序可以使得處於耗竭狀態的T細胞重新恢復活力，但我們仍然不能肯定活化CD8 T細胞的效應期後的重新甲基化程序是否是導致CD8 T細胞耗竭的本質的表觀遺傳分子機制，並且本篇文章也沒有對這個問題進行深入的探究。
2、本篇文章在Fig 6中所展示的Data在筆者看來並沒有能夠完全反映其小標題的內容（在提高耗竭CD8 T細胞恢復活性的潛能方面DNA去甲基化藥物的治療能夠先於PD-1阻斷治療），因為在筆者看來這部分的Data沒能說明DAC比PD-1阻斷先發揮作用，而是更多的表現了DAC能和PD-1協同作用來提高耗竭T細胞恢復活性的能力，並且在Fig 6B中DAC處理後anti-PD-L1處理前的時間節點中，DAC處理也沒有表現出相對於其他實驗組先出現的作用。
3、本篇文章最後一部分研究DNA甲基化的抑製劑DAC對TILs細胞活性恢復的作用時，只是分析了TILs的增殖能力，筆者認為這部分的研究應該像之前的實驗中加入對T細胞抗腫瘤效應能力的分析（如效應細胞因子如IFNγ的分泌），而不是只分析增殖能力，這樣更能增加這部分實驗的說服力。
其TA參與此次JC老師或同學的評論：
1. BIO-Sherlock的評論：
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