新晉諾獎得主邁克爾·揚：我用果蠅揭開生物鐘的面紗

2017年10月2日，美國遺傳學家邁克爾·揚（Michael W. Young）與傑弗里·霍爾（Jeffrey C. Hall）、邁克爾·羅斯巴什（Michael Rosbash）因發現晝夜節律的分子機制，共同榮獲2017年諾貝爾生理學或醫學獎。

下面這篇文章，由新科諾獎得主邁克爾 揚親筆撰寫，他為我們詳細介紹了他的團隊如何在果蠅中找出控制晝夜節律的基因。這一研究能夠幫助我們更好地理解，包括人類在內多種動物的生物鐘是如何工作的。

撰文 | 邁克爾·揚（Michael W. Young）

本文作者Michael W. Young

你必須克服想在晚上7點上床睡覺的衝動，下午3點你已飢腸轆轆，但過了晚餐時間就沒有任何食慾了，你凌晨4點醒來就無法再次入睡。這些情形對眾多從美國東海岸飛到西海岸加州的人來說是那麼熟悉，這種旅行必須經歷3小時的時差。為期一周的商務旅行或度假後，你的身體剛剛才適應了新的作息時間表，而你卻必須馬上返回家中，去再次適應以前的例行時間表。

我和同事幾乎每天都讓一批果蠅經歷從紐約到舊金山或從舊金山到紐約的模擬旅行的時差效應。我們實驗室有幾個冰箱大小的恆溫箱——一個貼上「紐約」標籤，另一個則貼上「舊金山」標籤。恆溫箱中的燈隨著兩個城市太陽的起落而照亮或熄滅。（為了統一起見，我們規定上午6點為日出，下午6點為日落，對兩個城市都是如此。）兩個恆溫箱的溫度都保持溫和的恆定溫度華氏77度（攝氏25度）。

果蠅在小玻璃管內進行模擬旅行，而玻璃管放在用一窄束紅外光監測果蠅活動的特殊裝置盤內。果蠅一飛進光束內，它就在裝置盤上的光電晶體管上產生一個投影，而光電晶體管則連接到用於記錄果蠅活動情況的計算機上。從紐約時間變到舊金山時間並不意味著我們的果蠅做了5小時旅行：我們僅僅是把放有果蠅的裝置盤從一個恆溫箱中拿出來，然後放入另一個恆溫箱中並連接好。

我們已經利用橫貫大陸的高速公路識別和研究了幾種基因的功能，這些基因似乎正是生物鐘構件中的齒輪，而生物鐘則控制著從果蠅到老鼠和人類等大量生物的晝夜周期。識別這些基因能讓我們確定它們所編碼的蛋白質，而這些蛋白質則可能成為大量疾病（例如睡眠失調和季節性抑鬱症）的治療方法的標靶。

人類生物鐘的主要齒是交叉上核（SCN），即腦底面一個區域（海馬）的神經細胞簇。每天早上，當光刺激視網膜的時候，特定的神經就向SCN傳遞信號，而SCN則控制著大量生物活性物質的產生周期。例如nSCN刺激稱為松果腺的一個間腦區域。根據來自SCN的指令，松果腺有規律地產生褪黑激素，即所謂睡眠荷爾蒙，現在許多保健食品商店有這種東西的藥丸出售。隨著白晝逐漸轉為黑夜，松果腺慢慢開始產生更多的褪黑激素。隨著這種激素在血液中的含量的提高，人體溫度略有下降，從而增強了睡眠傾向。

人類生物鐘

雖然光似乎每天都「重新啟動」生物鐘，但是甚至那些同光隔絕的人的晝夜節律依然繼續發生作用，這表明SCN的活動是與生固有的。20世紀60年代初期，當時在德國塞維森馬克斯普朗克行為生理學研究所的Jurgen Aschof及其同事揭示，自願受試者生活在與世隔絕的地堡中，沒有任何自然光，沒有鍾及其他有關時間的線索，然而他們大體上保持了25小時的睡一醒周期。

2000年左右，哈佛大學Charles Czeisler，Richard Kronauer及其同事已確定，人類晝夜節律實際上接近24小時，——準確地說是24.18小時。科學家研究了24位男女，其中11人20多歲，13人60多歲。他們讓這些人在沒有任何時間線索的環境中生活了3周多，只是人為設定了28小時的不明顯的明暗周期並給受試者睡覺信號。

他們測定了受試者的體核溫度（通常在夜間下降）、褪黑激素在血液中的濃度以及一種稱為皮質醇的應激激素在血液中的濃度（在晚間下降）。研究人員發現，就是把受試者的白晝時間非正常地延長4個小時，他們的體溫、褪黑激素和皮質醇的水平依舊按照自身的內部24小時節律時鐘發生作用。更為重要的是，年齡似乎對時鐘的活動沒有影響：這不同於以前的研究，先前的研究指出衰老擾亂了晝夜節律，而在哈佛大學研究中，較老受試者的體溫和激素含量變動都和年輕組的情形一樣正常。

就像上述隔離研究所富有的啟示性那樣，為了研究決定生物鐘的基因，科學家不得不轉向果蠅。果蠅生命周期短，個體小，研究人員能在實驗中培育和雜交數千果蠅，直到出現滿意的變異為止，因而它們是基因研究的理想材料。為加快變異過程，科學家通常讓果蠅接觸被稱為誘變劑的突變誘導化學物質。

20世紀70年代初期，加州理工學院Ron Konopka和Seymour Benzer識別出了揭示果蠅改變晝夜節律的第一批突變。這些研究人員喂幾隻果蠅吃了誘變劑，然後觀察2000個後代果蠅的活動，從部分意義上說，這採用了我們現在用於「紐約一舊金山」實驗的同一種裝置。結果，大多數果蠅都表現出正常的24小時晝夜節律：一天中，果蠅活動12小時左右，另外12小時休息。但有3隻果蠅發生了突變，打破了上述模式。其中一隻的節律周期是19小時，另一隻的周期是28小時，而第三隻則似乎沒有任何晝夜節律周期，好像是隨機地休息與活動。

果蠅的定時活動

1986年，我在洛克菲勒大學的研究小組與由布蘭迪斯大學的Jefrey Hall、布蘭迪斯霍華德休斯醫學研究所的Michael Rosbash團隊一同發現，3隻突變果蠅在被稱為Period（或Per）的單個基因上具有3種不同的變異，而這些變異都被我們兩個小組於2年前獨立分離出來了。由於同一基的不同變異導致了3種不同的行為，因此，我們得出結論，Per基因在某種程度上積极參与了果蠅晝夜節律的形成和節律幅度的確定。

分離出per基因後，我們開始提出這種基因在控制晝夜周期方面是否單獨起作用的問題。為了尋找答案，我實驗室的兩位博士後Amita Sehgal和Jeffrey Price篩選了7000多隻果蠅，看是否能識別出其他的節律變異。他們最後發現，1隻像具有Per基因變異果蠅的果蠅，沒有明顯的晝夜節律。結果證明，新突變發生在染色體2上，然而per基因被複制到了X染色體上。我們知道這必定是一種新基因，我們將其命名為timeless或tim基因。

那麼新基因和per基因具有怎樣的關係呢?基因是由DNA組成的，而DNA則含有製造蛋白質的指令。DNA從不離開細胞核，它的分子配方以信使RNA的形式讀出，而信使RNA離開細胞核進入細胞質，蛋白質就在此形成。我們利用tim基因和Per基因在實驗室里製造TIM蛋白和PER蛋白。在和哈佛大學醫學院Charles Weitz的合作f1I，我們發現，當混合兩種蛋白質的時候，它們就相互結合到一起，這表明它們可能任細胞內相瓦作用。

在一系列實驗中，我們發現PER蛋白和TIM蛋白的生產形成了一個鍾樣的反饋環。在per基因和tim基因的蛋白質濃度變得足夠高從而使二者相互結合之前，per基因和tim基因都是有活性的。當兩種蛋白質結合在一起時，它們就形成進入細胞核的複合體，關閉製造蛋白質的基因。幾小時之後，酶降解蛋白質複合體，基因重新打開，循環又一次開始。

移動生物鐘的指針

當我們發現兩種基因協同作用形成生物鐘的時候，我們立刻開始想知道怎樣重新啟動生物鐘。畢竟，我們的睡一醒周期完全適應跨越任何小時區的旅行，儘管調整時差可能要花兩天或兩周時間。

這就是我們開始在「紐約」恆溫箱和「舊金山」恆溫箱之間把果蠅裝置盤穿梭搬動時的想法。我們和其他研究人員看到的第一批結果之一就是，不論何時將果蠅從黑暗的恆溫箱搬到光芒耀眼（模擬日光）的恆溫箱，果蠅腦中的TIM蛋白質都會在幾分鐘內消失。

更有趣的是，我們注意到，果蠅「旅行」的方向影響著TIM蛋白質的水平。如果我們在「紐約」時間下午8點（已是黑夜）將果蠅從「紐約」移至「舊金山」，此時「舊金山」時間是下午5點，依然陽光普照，果蠅的TIM水平急劇下降。但是1小時後，當「舊金山」的陽光消逝的時候，TIM開始重新積累起來。顯而易見，起初，果蠅的分子鐘因轉移而停息下來，但停留一陣時間之後，它們又以新時區的方式重新滴答滴答地走起來了。

與此對照，果蠅下「舊金山」時間上午4點移到「紐約」時，「紐約」時間就是上午7點了，它們其間經歷了一段太陽初升的時光。這次旅行也導致TIM水平下降，但這一次蛋白質不再重新形成，因為分子鐘因時區轉換而提前了。

通過考察tim RNA產生的時間性，我們更多地了解到了隱藏在不同分子反應後面的機制。大約在當地時間晚上8點，tim RNA的含量最高，上午6點至8點之間最低。果蠅在晚上8點從「紐約」飛到「舊金山」時產生最高水平的tim RNA含量，因而在「舊金山」接觸光線而造成的蛋白質損失在「紐約」太陽落山之後極易得到彌補。如果果蠅凌晨4點從「舊金山」飛到「紐約」，那麼它在出發前產生很少的tim RNA。而經歷太陽初升的果蠅則消除了TIM蛋白，而使下一個形成周期開始得更早。

並非只有果蠅才如此

業已證明，對果蠅進行時滯處理對理解包括人類在內的哺乳動物的晝夜節律具有直接的意義。1997年，東京大學Hajime Tei和神戶大學Hitoshi Okamura領導的研究人員以及貝勒醫學院Cheng Chi Lee獨立地在老鼠和人中分離出了相當於果蠅per基因的東西。1998年許多實驗室參與的另一項研究發現了老鼠和人類tim基因，這些基因在上交叉核中活動。

對老鼠進行的研究還有助於回答以下的關鍵問題：什麼因子首先觸發per基因和tim基因的活動?1997年西北大學霍華德休斯醫學院Joseph Takahashi及其同事分離出了他們稱之為Clock的基因，當老鼠的這種基因發生變異時，就沒有任何清楚的晝夜節律了。該基因編碼一種轉錄因子，也就是一種蛋白質，在這種情形下，該蛋白質結合到DNA上並使DNA以信使RNA的形式讀出。

老鼠Clock基因分離出來之後不久，幾個研究小組就開始將per，tim和Clock三種基因的融合體引入哺乳動物和果蠅細胞之中。這些實驗表明，Clock蛋白的靶子是老鼠的per基因以及果蠅的per和tim兩種基因。這種機制具有完整的周期：對其分子鐘了解得最透徹的果蠅而言，Clock蛋白同一種由稱為cycle的基因編碼的蛋白質一起結合到tim和per兩種基因上並使其產生活性，但只有在細胞核中沒有任何PER和TIM這兩種蛋白質時才如此。這四種基因及其蛋白質構成了果蠅生物鐘的核心，並且經過某些，改進，它們似乎就形成了控制整個動物界一從魚類到青蛙，從老鼠到人類～晝夜節律的機制。

隨後，哈佛大學Steve Repper小組及我實驗室的Justin Blau開始探索聯繫老鼠和果蠅生物鐘同各種行為、激素變動其他功能之定時性的特殊信號。某砦輸出基因似乎被與CLOCK蛋白的直接相互作用所連通。與此同時，當PER和TIM兩種蛋白產生中心反饋環的變動——從而形成周期性基因活動的擴展類型時，它們就阻礙Clock蛋白接通輸出基因。

激動人心的前景是恢復諸如果蠅和老鼠等生物的整個時鐘調節基因系統。先前沒有得到描述的具有迷人效應的基因產物可能在這些網路中被發現。這些基因之一或者說分子鐘的一個組成部分本身將成為緩和時滯、輪班副作用、以及睡眠失調及相關抑鬱疾病之藥物的標靶。總有一天，適應從紐約到舊金山的旅行會變得更容易。

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