冷凍電鏡：一個發給了物理學家的諾貝爾化學獎，獎勵他們幫助了生物學家

2017年諾貝爾化學獎授予三位冷凍電鏡領域的學者

「他們對冷凍電鏡技術的發展做出突出貢獻」

獲獎人簡介

約阿基姆·弗蘭克（Joachim Frank）

德裔生物物理學家，現為哥倫比亞大學教授。他因發明單粒子冷凍電鏡（cryo-electron microscopy）而聞名，此外他對細菌和真核生物的核糖體結構和功能研究做出重要貢獻。弗蘭克2006年入選為美國藝術與科學、美國國家科學院兩院院士。2014年獲得本傑明·富蘭克林生命科學獎。

理查德·亨德森（Richard Henderson）

蘇格蘭分子生物學家和生物物理學家，他是電子顯微鏡領域的開創者之一。1975年，他與Nigel Unwin通過電子顯微鏡研究膜蛋白、細菌視紫紅質，並由此揭示出膜蛋白具有良好的機構，可以發生α-螺旋。近年來，亨德森將注意力集中在單粒子電子顯微鏡上，即用冷凍電鏡確定蛋白質的原子解析度模型。

雅克·迪波什（Jacques Dubochet）

Jacques Dubochet, 1942年生於瑞士，1973年博士畢業於日內瓦大學和瑞士巴塞爾大學，瑞士洛桑大學生物物理學榮譽教授。Dubochet 博士領導的小組開發出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術製作不形成冰晶體的玻璃態冰包埋樣品，隨著冷台技術的開發，冷凍電鏡技術正式推廣開來。

事實上，早在2015年《自然》雜誌旗下子刊Nature Methods將冷凍電鏡技術（cryo-EM）評為年度最受關注的技術，我們邀請了劍橋大學MRC分子生物學實驗室博士後張凱系統介紹冷凍電鏡發展，同時也對在這一領域做得非常出色的華人科學家程亦凡教授進行了專訪。

此次冷凍電鏡技術獲得諾貝爾化學獎實至名歸。如下為北京生命科學研究所研究員何萬中的點評。

冷凍電鏡技術為何摘得2017年的諾貝爾化學獎

撰文 | 何萬中（北京生命科學研究所研究員）

知識分子為更好的智趣生活ID：The-Intellectual

2013年，冷凍電鏡技術的突破給結構生物學領域帶來了一場完美的風暴，迅速席捲了結構生物學領域，傳統X射線、傳統晶體學長期無法解決的許多重要大型複合體及膜蛋白的原子解析度結構，一個個被迅速解決，紛紛強勢佔領頂級期刊和各大媒體版面，比如程亦凡博士、施一公博士、楊茂君博士、柳正峰博士所解析的原子解析度重要複合體結構，震驚世界。

這場冷凍電鏡革命的特點是：不需要結晶且需要樣品量極少，即可迅速解析大型蛋白複合體原子解析度三維結構。這場電子顯微學解析度革命的突破有兩個關鍵技術：直接電子相機（其中演算法方面程亦凡博士和李雪明博士有重要貢獻）和三維重構軟體。

引領這些技術突破的背後離不開三位冷凍電鏡領域的開拓者：理查德·亨德森（Richard Henderson）、約阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank）和 Jacques Dubochet分別在基本理論、重構演算法和實驗方面的早期重要貢獻。

我本人與這三位科學家都有曾過面對面的交流，也是讀他們的文章進入這個領域的，下面簡要談談他們的貢獻。

電子顯微鏡於1931年發明，但在生物學領域的應用滯後於材料科學，原因在於生物樣品含水分才會穩定，而電子顯微鏡必須在高真空下才能工作，因此如何製作高解析度生物電鏡樣品是個技術瓶頸。傳統的重金屬負染技術，可以讓重金屬包被蛋白表面，然後脫水乾燥製作適合真空成像的樣品，但這會導致樣品解析度降低（至多保存1.5納米）。

1968年，英國劍橋大學MRC實驗室的Klug博士和他的學生DeRosier開創了基於負染的噬菌體病毒的電鏡三維重構技術（Klug 博士獲1982年諾貝爾化學獎）。但如何保持生物樣品原子解析度結構又適合電鏡成像呢？加州大學伯克利分校的Robert Glaeser博士和他學生Ken Taylor 於1974年首次提出並測試了冷凍含水生物樣品的電鏡成像，可以有效降低輻照損傷對高解析度結構破壞和維持高真空，實現高解析度成像的新思路，這就是冷凍電鏡（CryoEM）的雛形。

冷凍電鏡樣品製作流程，圖片來自creative-biostructure.com

1982年，Dubochet 博士領導的小組開發出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術製作不形成冰晶體的玻璃態冰包埋樣品，隨著冷台技術的開發，冷凍電鏡技術正式推廣開來。

在Klug博士提出的三維重構技術基礎上，MRC實驗室的Richard Henderson博士（物理學及X射線晶體學背景）跟同事Unwin 博士1975年開創了二維電子晶體學三維重構技術，隨後應用該技術技術解析了第一個膜蛋白細菌視覺紫紅質蛋白的三維結構，1990達到3.5埃，這是一個非常了不起的工作，但是第一個類似的膜蛋白結構的諾貝爾獎還是被X射線晶體學家米歇爾於1988年奪走了。二維晶體最大問題在於很難長出二維晶體，因而應用範圍很窄，且容易被X射線晶體學家搶了飯碗（本人剛入行第一個薄三維晶體項目就被搶了）。

上世紀90年代，Henderson博士轉向了剛興起的另一項CryoEM三維重構技術，即Joachim Frank 博士發展的單顆粒分析重構技術，無需結晶就可以對一系列蛋白或複合體顆粒直接成像，對位平均分類，然後三維重構。Henderson 博士憑藉他深厚的物理學及電子顯微學功底，以及非凡的洞察力，提出實現原子解析度CryoEM技術的可行性，在理論上做了一系列超前的預見，比如電子束引起的樣品漂移必須解決才能實現原子解析度，為後期直接電子相機的突破指明了方向，他本人也投身於直接電子相機的開發。

因此，在這場電鏡解析度的革命中，Henderson博士是個不折不扣的發起者。另外，三維重構新演算法的突破也有Henderson 博士的獨具慧眼有關，Sjors Scheres博士在沒有很強論文情況下被他看中招募到MRC後因為開發經典的Relion 三維重構演算法大放異彩。

最後，我們再介紹一下發展冷凍電鏡單顆粒三維重構技術的Joachim Frank博士，他也是物理學背景。Frank 博士是單顆粒分析鼻祖，單顆粒三維重構演算法及軟體Spider的作者。

Frank 師從德國著名的電子顯微學家Hoppe博士，Hoppe學派主張對任意形狀樣品直接三維重構，後來的電子斷層三維重構及cryoEM三維重構技術都與他的早期思想有關。Frank博士提出基於各個分散的全同顆粒（蛋白）的二維投影照片，經過分類對位平均，然後三維重構獲得蛋白的三維結構，發展了一系列演算法並編寫軟體（SPIDER）實現無需結晶的蛋白質三維結構解析技術。尤其在核糖體三維重構方面有一系列的重要開創性工作，可惜當年核糖體結構諾貝爾獎沒有給他。現在給他在cryoEM單顆粒三維重構的一個諾貝爾獎，實至名歸。

製版編輯： 常春藤｜

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