從龍套到大腕：冷凍電鏡技術的逆襲-新年展望的編年記錄
今年的諾貝爾化學獎頒給了Jacques Dubochet，Joachim Frank，和Richard Henderson，表彰他們在開發冷凍電鏡技術解析水溶液中生物大分子高解析度結構的開創性貢獻。就在10年前，冷凍電鏡技術還相當小眾，而在短短的4年時間裡，這個技術迅速地成為結構生物學家的新寵，並在今天獲得了諾貝爾獎委員會的認可，這確實是一個驚人的成就。我自從2014年以來，每年元旦給自己實驗室的成員們寫一封信，把冷凍電鏡技術上一年的成就做個簡單總結，也對新一年做個展望。如今回顧起來，還是很有意思的。如下做些簡單的整理，希望對大家理解冷凍電鏡過去幾年的發展狀況有所幫助。
2014年1月1日
2013年對我們的冷凍電子顯微學領域來說是具有標誌性的一年。由於新的硬體技術及演算法的革命性進步，單顆粒技術使得直接揭示生物大分子複合體的原子解析度結構成為可能。尤其是對較小分子量（300kDa）的複合物結構的解析，標誌著冷凍電鏡將完全擺脫X射線晶體學，發揮其獨特的對低濃度溶液狀態的分子結構進行直接觀察的特點，作為獨立的結構生物學研究手段，研究生物大分子複合體的原子解析度結構。這些新技術的迅速推廣將帶來更多重要的研究手段的變革。完全可以想像，對細胞、細胞器、體內等超微結構的精細觀察也將對細胞生物學、發育生物學、神經生物學、免疫學等多個學科帶來眾多新的契機。
2015年1月1日
2014年可謂是冷凍電鏡領域的狂歡之年。那些在這個領域耕耘數十年，卻一直在結構生物學聚光燈遠端的先驅們，興奮於他們的有生之年居然看到了這個領域的逆襲成功。這個對比太強烈，以至於他們多年來養成的低調與謙遜品格尚無法適應突然發生的激烈競爭與隨之而來的巨大榮光。剛剛進入這個領域不久的年輕人們，則好像買彩票中了大獎一樣，慶幸自己在最好的時機進入了這個前途一片光明的領域。最近兩年來的工作機會多的不得了，所有的研究型大學都摩拳擦掌要建立自己的冷凍電鏡研究方向，彷彿誰還沒有從事冷凍電鏡研究的faculty誰就不是在做科研似的。Postdoc和facility manager的廣告更是鋪天蓋地，做冷凍電鏡的PhD們有福了。
事實上，冷凍電鏡這個技術的發展，比我想像的還要快。比方說，gamma-secretase的結構從開始制樣到解析出4.5埃的結構只用了不到2個月，超出所有人的想像力。我們利用清華的設備，從僅僅兩批數據中即將一個180KDa沒有任何對稱性的蛋白質influenza RNA-dependent RNA polymerase解析至4.8埃，也是對當今冷凍電鏡新技術的超強能力的一個明證。最新一期Nature上連續三篇Ryanodine Receptor（RYR）蛋白質的結構，分別達到6.5埃，4.5埃和3.8埃的解析度，終於將這個單顆粒冷凍電鏡研究的經典分子結構推至了原子解析度。這個樣品從1980年代開始研究，30年後，在短短的一年內獲得巨大突破，不能不說是技術的奇蹟。想像一下：如果你在30歲左右開始做一個項目，直到你快退休了，才終於解析了出了結構，而且還不見得是你自己解出來的。Joachim Frank從1985年發表第一篇有關RYR的電鏡結構，到今年剛好30年。我想，他應該感到欣慰的是：他還是趕上了2015年的這一波結構解析突破，雖然不是最高解析度。
毫無疑問，冷凍電鏡在不遠的將來會被科學界所接受。我可以大膽地預測，未來兩年內冷凍電鏡單顆粒重構技術會獲得某獎委員會的青睞，摘得明珠。作為冷凍電鏡領域的研究者，我們似乎應該感到榮幸之至。但是擺在各位眼前的現實情況其實是很殘酷的。因為冷凍電鏡技術尤其是在單顆粒高解析度解析技術上的發展與成熟，該技術的進入門檻大大降低，冷凍電鏡研究者所特有的技術優勢和多年積累的技術經驗很快就將過時。與最新大量湧入該領域的晶體學家和生物化學家們相比，我們在最新的技術面前幾乎是在同一個起跑線上，而且我們在蛋白質化學的經驗上還遠遠落後於他們。因此，我們面臨著領域內外的雙重壓力。一方面，我們要儘快地掌握最新的冷凍電鏡技術，努力挖掘這些新技術尚未被充分利用的潛力，保持自己在領域內的先進地位；另一方面，我們需要繼續保持這個領域一貫的謙虛態度，努力從晶體學家、生物化學家那裡學會製備樣品的嫻熟技術。這與我自己10年前從事冷凍電鏡研究的方式已經是天壤之別。
2016年1月1日
在2015年里，傳統的X射線晶體學實驗室已經全線進攻，成為冷凍電鏡技術的最大用戶與贏家，在這一年裡斬獲頗豐。清華因為在蛋白質化學方面的領先優勢以及在冷凍電鏡平台設施建設和結構解析經驗積累等方面提前布局，短短的一年裡，即先後取得了多項世界級的冷凍電鏡結構解析成果。「友邦人士，驚詫莫名」！5年前很多暗地裡嘲笑我或者表示不理解我放棄耶魯的教職回到清華的冷凍電鏡同行們今天對我的態度完全是「你當初真是有膽有識，執行力超強，令人佩服…。你們的機時能不能給我幾天？…你們清華沒有人在做這個樣品吧？…」
單顆粒冷凍電鏡技術的巨大進展使得很多大分子複合體的高解析度結構解析變得超乎想像的迅速。施一公教授團隊在spliceosome結構解析上的巨大突破令無數的科學家跌破眼鏡。不只是因為施一公團隊並非被傳統研究spliceosome的課題組所了解，更是因為這個複合體居然可以被解析到原子解析度！近20年來，已經有無數的實驗室採用晶體學手段和冷凍電鏡手段研究spliceosome。大家形成的基本結論是，這個複合體太複雜，太動態，要了解它的結構還需要很多工作，很多努力。施一公實驗室憑藉他們在生化技術上的豐富經驗和判斷力，並且正因為沒有受到傳統冷凍電鏡實驗室的各種觀念束縛，憑藉初生牛犢不畏虎的勇氣，放手一搏，結果在短短的半年裡即擷取了明珠。這個例子充分證明了冷凍電鏡新技術革命潛力之大，絕大多數人都還沒有準備好。
很多人問我：冷凍電鏡技術象現在這樣的好日子會支撐多久，未來5-10年的工作機會是否還象今天這樣多？這其實是一個假問題。冷凍電鏡技術一直在不停的演化和發展中，未來5-10年的技術方法跟今天相比將很不一樣。我們今天正在使用的感覺很前沿的手段在2016年就將是常規手段（當然，在世界的其它地方，可能還是前沿）；最近剛剛出現的一些新技術（如相位板技術、sub-tomogram averaging技術）對我們來說還是前沿技術。只有不滿足於現狀，一直不停地開發和建立新的研究技術手段、一直研究最困難的生物學問題，我們才始終處於潮流的最前面。這樣無論冷凍電鏡技術發展到什麼狀態，或者結構生物學變成什麼模樣，我們都始終立於不敗之地。我對各位的忠告就是：sharpen your mind，smoothen your hands，strengthen your gut，broaden your vision。你們未來的工作機會不是由這個領域的發展狀況來決定的，而是由你自己的本領與意志來決定的。
其實冷凍電鏡在過去幾年裡的迅猛發展，帶給整個結構生物學的是一個新的契機，同時也是一個巨大的挑戰。我時刻用自己多次演講中的一張slide來提醒自己：當解析一個生物大分子的原子結構變得跟跑一塊SDS-PAGE一樣迅速時，結構生物學家們將如何自處？按照目前技術發展的出人意料的速度，我甚至可以預料：5年以後的博士研究生僅靠解析一個高解析度結構幾乎不可能畢業。正如我們今天進行基因測序是個常規手段一般，未來的結構解析將只是為了解答生物學問題的一個基本步驟，可能是主要研究手段，但不是目標。結構生物學永遠要圍繞著「生物學」這個問題，因而無論是X射線晶體學，還是冷凍電子顯微學，其方法學發展的目的是為了解決生物學問題。簡單的追求高解析度絕對不是我們的研究目的；很多重要的生物學問題在低解析度水平上也可以得到很好的解答；單純的獲得結構也不是我們的終極目標。系統的生化分析，功能研究是驗證結構提示的模型正確與否的必要手段，而且會為結構的研究指出新的目標。結構生物學的研究方式將從現在對結構解析實驗技巧的提高和實驗參數的摸索轉為關注於對結構的理解，從中獲得重要的生物學啟示，並設計新的結構解析實驗和功能實驗來驗證重要的假說。未來的結構生物學家，必須是個好的生物學家，是個善於聯想，可以見微知著，可以迅速地將結構信息與功能、與宏觀問題聯繫起來的思考者。如何成為這樣的好的生物學家？廣泛地閱讀，積極地交流，並保持對生物學問題的持久興趣。這也是我為什麼總是鼓勵大家多看看與自己領域貌似無關的論文、科普書籍、甚至人文書籍的原因。結構生物學研究的最長久的驅動力是對生命現象、對人類命運的好奇心，而不是某個具體技術的興衰。
2017年1月1日
國際冷凍電鏡的學術群體將持續發展和分化。在傳統的冷凍電鏡實驗室中，那些以結構解析為目標的實驗室將面臨越來越大的來自晶體學實驗室的挑戰，而那些推進方法學開發的實驗室則需要努力保持自己的科研風格，用足夠遠的視野來指導方法學的開發。我們實驗室現在所關注的技術問題，包括新的成像方法、對小分子量蛋白質分子的結構解析、對新的制樣技術的開發，都是冷凍電鏡技術的一些前沿問題。這些問題的解決將可能將冷凍電鏡從簡單的結構解析手段變成一個更強大的生物物理學手段，揭示更多的諸如動態變化或能量分布等深層次的分子機制。
在未來的2-3年里，主要的技術突破將主要發生在冷凍樣品製備、構象變化的解析演算法、細胞內tomography的三維重構質量的提高上，而相位板的大規模應用及更有效的相位板的開發必將成為重中之重。如果現在還有人沒有直接電子探測相機，就幾乎不能說自己是做冷凍電鏡的；到了2019年如果還沒開始使用相位板成像，就一定會落伍。我希望到2019年的新年展望時候可以宣布，如果還沒有使用清華實驗室開發的某某方法，就一定會被歷史淘汰。
我與諸位有幸生活在這個時代，親眼目睹並參與一個新的領域的崛起，是非常興奮的。我們現在要思考的問題是，如何在這個新崛起的領域中站穩自己的腳跟，發揮自己的特長，充分利用這個機會發現新問題，開發新方法。我們一方面絕不能被滾滾向前的發展洪流所淹沒，另一方面也絕不能只是滿足於重複已經被他人證明是成功的研究手段。我們每個人的知識背景，興趣愛好，思維方式各異；每個實驗室的科研作風，科研思路，科研興趣不同。如何學會結合自己的特點，把自己的興趣特長充分在自己的科研課題中發揮出來，這是博士訓練最為重要的目標；同時，敢於迎接挑戰，敢於嘗試並學習新的技術，新的方法，涉足新的領域，這種勇氣以及將其付諸實施的毅力是成功的科學家所必備的素質。
當我們回顧歷史時，總會懷著一種美好的心情想像那些重要科學發現的時刻是多麼的激動人心，卻往往忘記了在達到那之前的寂寞與辛苦。我有幸跟冷凍電鏡領域的很多歷史性人物交流他們的過往，發現即使是那些先驅與前輩們，也懷揣著最為甜蜜的心情，用最得意的口吻回憶他們自己的辛苦奮鬥。從事科學事業的最大成就感莫過於親身參與和創造了歷史。與此相比，一切俱成過往。開創冷凍電子顯微學技術的老祖宗Robert Glaeser曾經接受我的邀請於2016年5月份來清華與大家一起討論該領域目前最前沿的幾個技術問題，包括冷凍制樣和相位板技術。你們已看到一個真正的科學家、信仰者、開拓者是如何步履蹣跚地走到今天，並且還在躑躅前行的。（題外話：雖然這次的諾貝爾獎沒有頒發給Robert Glaeser，他對於冷凍電鏡技術的原創性貢獻是無法抹滅的。時至今日，近80歲的老先生仍然活躍在科研的第一線，親自做實驗，寫論文，並毫無保留地把他的各種想法講給年輕人聽，希望更多人參與到他對更新技術的探索中去。這是不為任何功利驅動的真正的科學精神！）
清華從隋森芳教授開始，一直在創造中國冷凍電子顯微學的歷史。我的一個夢想就是把清華建成冷凍電鏡技術的發源地之一，有一天可以跟我的後輩們得意地描述我們如何在未知中每邁一步之前的心中忐忑、小腿發顫、以及毅然決然。很高興各位願意與我同行，幫我一同探索迷霧中不知名的寶藏。我殷切地希望大家能更大膽，更心細，更心無旁騖，走別人沒走過的路。
