單分子實時測序技術Oxford Nanopore
Nanopore技術自從面市就引起了廣泛的關注，但國內一直沒有關於此項技術測序數據的報道，直到上周北京未來組公司在國內第一次公布了該技術的測序數據同時刷爆了各大測序媒體，小編很有幸也參與了該項工作。相信大家對這個測序儀都充滿了好奇，那麼我們就先來看下它的外觀吧
這三款測序儀的區別在於：
MinION:只含有一個流動槽，適用於臨時實驗室或極端野外環境的即時採樣提取測序
GrodION X5:含有五個流動槽，可單獨使用或協同使用流動槽適用於大型基因組學項目或多樣本項目的測序
PromethION:含有四十八個流動槽，國內目前還沒有此機型
測序原理
Nanopore測序儀的核心是一個由4組512個納米孔組成，由專用集成電路控制的flow cell。如圖A所示，待測物流經納米孔會導致電流發生變化，nanopore則是通過檢測這些電流變化並通過分析來得到待測序列的。
1D測序的建庫過程則是如圖B所示：超大分子量的DNA序列先經過打斷（此步驟是為了加大接頭連接的效率）；修復及末端修復後加上一個y接頭，y接頭處的橙黃色圓點代表的是馬達蛋白，這個蛋白的作用是1.控制DNA序列通過納米孔的速度（目前的速度為450bp/s）2.使得DNA分子解鏈讓其單鏈通過納米孔；最後再加上Tether，在圖中以綠色圓點表示，這個的作用是引導DNA鏈到有納米孔的膜上，並與膜結合從而使馬達蛋白與納米孔結合進行測序。這個建庫過程為1D技術，只能測編碼鏈，該技術的準確率在90-92%。現在最新的1D2測序可以測編碼鏈和互補鏈，因此準確率也更高。
1D2測序技術的建庫過程與1D相似，也是打斷，修復後連接接頭，這邊值得注意的是：在1D2中使用的晶元上的膜與1D的有差別，這個膜與tether蛋白的連接作用力更大，當編碼鏈完全通過納米孔後，由於編碼鏈末端的tether與膜依舊緊密連接會使連接在互補鏈上的馬達蛋白與納米孔結合，從而開始對互補鏈的測序如圖c所示，該技術的準確率在95-97%。很遺憾的是這個測序技術目前並不面向中國開放。
Nanopore VS PacBio：
1.測序原理：Nanopore主要基於DNA分子通過納米孔時引起電流的變化，將電信號轉化為鹼基序列信息；PacBio基於邊合成邊測序(sequencing-by-synthesis，SBS)原理進行測序。
2.設備大小：Nanopore機器如MinION很小，可以手持；PacBio機器比較大無法手持。
3.Reads長度：在Nanopore中用於測序的馬達蛋白主要起到的是控制速度和解鏈的作用，因此理論上Nanopore測得的序列長度取決於上樣時的序列長度；PacBio則是通過邊合成邊測序的原理，其中用來合成新鏈的DNA複製酶很脆弱，非常容易失活，因此雖然理論上PacBio也能有長reads但是這個取決於酶的活性。
4.DNA測序：Nanopore是對DNA鏈直接測序可以直接獲得DNA鏈上的甲基化修飾結果較PacBio更為準確有效。
5.RNA測序：Nanopore也可以對RNA進行直接測序，並不需要反轉成cDNA，可以避免反轉和PCR中的錯誤可以直接獲得RNA中的信息。這點也是PacBio沒辦法做到的。但是目前不用反轉測得RNA序列的技術並不對中國開放。
Nanopore配套軟體
文中部分丑圖均為小編手繪，有礙觀瞻，請諒解
參考文獻：[1] Oxford Nanopore公司宣講PPT[3]O』Donnell CR, Wang H, Dunbar WB. Error analysis of idealized nanopore sequencing.Electrophoresis. 2013;34(15):2137-2144.
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