為啥冷凍電鏡技術得諾獎：這個「殺手級」技術有點「冷」

最近 cryo-EM 的進展讓研究人員能夠在近原子解析度上確定蛋白結構，從而極大地擴展了這 種技術的生物學適應性。

β- 半乳糖苷酶（β-galactosidase）真算 不上是一個迷人的蛋白，早在幾十年前，它 的結構便已被 X - 射線晶體衍射技術（X-ray crystallography）確定了。β- 半乳糖苷酶被人 熟知的生物化學特性讓它成為被人們廣泛使用 的基因表達實驗監測因子。然而誰都沒想到， 2015 年 6 月，這個「踏實幹活」的酶卻成為了 結構生物學領域的超級明星。通過精心優化他 們的單顆粒 cryo-EM 技術，美國國立癌症研究 所（US National Cancer Institute）的 Sriram Subramaniam 等人以平均 2.2 ?的空間解析度 解析了β半乳糖苷酶。這個解析度屬於近原子 水平，並且曾一度被看做 X - 射線晶體衍射技 術的專屬解析度。Subramaniam 等人的成果 使研究人員得以放大α- 螺旋和氨基酸側鏈，從 而仔細觀察水分子，甚至單個的離子。

據 Subramaniam 回憶，在這項研究前的 幾個月，他的一位同事在與他書信往來時直截 了當地告訴 Subramaniam，要達到這種分辨 率是不可能的。這位同事很早就認定，單顆粒 cryo-EM 技術的解析度只能達到 3 ?，不可能 再提高了。現在 Cryo-EM 的先驅者已經成功地 往前邁進了一大步，可以研究更細小、更活躍 的蛋白，這只是過去幾年裡，證明那些反對聲 音是錯誤的新興技術取得的一系列勝利中的一 個。雖然目前 X - 射線晶體衍射技術仍然是結 構生物學領域不可動搖的首選技術，但是越來 越多的研究人員已經被採用 cryo-EM 能在原子 或近原子解析度水平解析單個蛋白分子結構的 應用前景所吸引，因為這種技術無需像晶體衍 射技術那樣，需要改進或掌握非常繁瑣的操作 以探索蛋白複雜的機制。

打破僵局

Dorothy Hodgkin 因開發了蛋白晶體衍射 技術而獲得了 1964 年的諾貝爾化學獎。到了 20 世紀 60 年代末，該技術漸趨完善，這讓某 些年輕的結構生物學家渴望新技術的出現。哥 倫比亞大學（Columbia University）的研究員 Joachim Frank 表示，這項技術已沒有任何挑 戰可言，他可不想繼續鑽研了。

EM 的解析度達到原子級別，可用於解 析 3D 結構，它是晶體衍射技術的一種前景光 明、但是未經驗證的替代方法。英國劍橋醫 學研究委員會分子生物學實驗室（Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, MRC LMB）的 David De Rosier 和 Aaron Klug 於 1968 年用一張噬菌體尾部 EM 照 片首次對 EM 進行了驗證。然而，用於獲取生 物樣品高信噪比圖像的樣品製備技術（脫水和 使用重金屬進行染色處理）卻導致圖像失真， 模糊了圖像中分子的細節。

歐洲分子生物學實驗室（European Molecular Biology Laboratory, EMBL）的 Jacques Dubochet 根據勞倫斯—伯克利實 驗室（Lawrence BerkeleyLaboratory）的 Kenneth Taylor 和 Robert Glaeser 設計的方 法，開發出一款新技術。該技術在一塊很薄 的玻璃化冰膜上凍結仍處於天然、水合狀態 的樣品。這種比冰晶還要透明的玻璃化冰膜 可以減少圖像偽影。自此，cryo-EM 領域誕生 了。據該領域另一位先驅，來自 MRC LMB 的 Richard Henderson 回憶，1984 年時他安排了 一位學生去聽 Dubochet 的課。這名學生學成 歸來時告訴 Henderson，cryo-EM 技術才是未 來所在。

最早期的 3D 結構是由多個對稱或高度 有序結構，例如病毒粒子的 2D 圖像組裝而 成的。如果想要獲取不對稱的結構圖像， 就需要重新藉助晶體衍射技術了。在晶體 衍射技術中，高度有序的 2D 晶體可以將目 標蛋白鎖定在特定的取向，這樣便可拍攝 出目標蛋白不同角度的圖像。1990 年，在 電子晶體衍射技術的幫助下，Henderson 等 人採用 EM 首次以原子解析度解析了蛋白結 構，這個蛋白就是光響應蛋白細菌視紫紅質 （bacteriorhodopsin）。然而，相較於 X - 射 線晶體衍射技術，電子晶體衍射技術的優勢 並不十分明顯。馬克斯普朗克生物物理研究 所（Max Planck Institute of Biophysics）的 Werner Kühlbrandt 指出，對電子晶體衍射技術來說，比起獲取高質量的膜蛋白的 3D 晶 體，要獲取高質量的該蛋白的 2D 晶體並不是 一件容易的事，甚至還有一定難度。

2 0 世紀 7 0 年代中期， 在劍橋大學 （University of Cambridge）任職博士後研究 員的 Frank 試圖越過晶體，僅僅依靠由大量單 個分子組成的分子群來獲取高解析度的蛋白結 構。Frank 承認自己的想法有點瘋狂，因為當 時的行業共識就是你必須要保留有序晶體這一 步。Frank 的做法是不直接解決無序單顆粒的 異質性問題，轉而通過捕獲大量隨機分布的顆 粒的 2D 投影來解決這個問題，隨後採用演算法 來對這些投影進行分類，最後將它們組裝成 3D 圖像。Frank 等人於 1991 年發表了他們首 個核糖體單顆粒 cryo-EM 結構；不到 10 年，他 們又取得了新進展，以接近 10 ?的解析度解 析了該蛋白結構。

儘管如此，在接下來的 20 多年裡，該領 域仍然籠罩在晶體衍射技術的陰影下，因為這 段時間內，晶體衍射技術一直在解析膜蛋白 結構方面不懈努力，最終讓人們得以仔細觀 察蛋白細節，而單顆粒 cryo-EM 的研究人員則 仍在費勁地解析相對較大的蛋白結構域。珍 利亞研究園區（Janelia Research Campus） Nikolaus Grigorieff 表示，許多人都質疑 cryo- EM 的合理性，同時調侃這種技術為「一團漿 糊學（blob-ology）」。

超越「漿糊學」

既要獲取結構細節，又不想破壞脆弱的樣 品，這真是一個兩難的抉擇。低電子量不會破 壞蛋白樣品，但這樣只能獲得低信噪比的雜訊 圖像。直到幾年前，cryo-EM 的研究人員仍然 只能費力地使用照相感光膠片獲取這些圖像， 或犧牲靈敏度，藉助電荷耦合器件（chargecoupled device, CCD）攝像機實現自動檢測 功能。

直到可以直接響應單個電子的、靈敏度 非常高的檢測器出現，cryo-EM 研究領域才發 生了翻天覆地的變化。其中一種由一個歐洲 協會和 Henderson 聯合開發的「直接電子探測 器」的研究基礎就是一款粒子物理學原型。據 Henderson 回憶，只要將這個探測器放進他們 的顯微鏡里，就立即可以看到單個電子，並且 能判斷這個電子是否運作良好。隨後，這款 探測器被 FEI 商品化，同時，Direct Electron 公司和加州大學聖地亞哥分校（University of California at San Diego）的研究人員 Mark Ellisman 和 Nguyen Huu Xuong 共同開發了一 款相似的探測器。靈敏度的提高表明了該技術 發生了重大飛躍。MRC LMB 的研究人員 Sjors Scheres 表示，將這款檢測器與 CCD 結合起 來，他們就可以拋棄 90% 的電子了，現在每 兩個電子就有 1 個能被他們檢測到。在某些情 況下，檢測效率甚至可以達到 80%。

第三款檢測器由 G a t a n 公司、 勞倫斯— 伯克利實驗室（ L a w r e n c e BerkeleyLaboratory）的 Peter Dennis 以 及加利福尼亞大學三藩分校（University of California at San Francisco, UCSF）的 David Agard 聯合開發。這款檢測器具有另一 種優勢。雖然所有的直接探測器都可以在測量 周期內捕獲追蹤電子信號的多幀電影圖片，但 是 Gatan 公司的 K2 還能計算電子的數目，而不 是僅僅記錄它們。這個特點對捕獲細小蛋白的 低解析度結構信息非常有幫助，因為這些信息 很容易融入背景而消失不見。位於紐約結構 生物學中心的美國國家自動分子顯微技術資 源網（US National Resource for Automated Molecular Microscopy, NRAMM）的 Bridget Carragher 指出，如果在那些頻率上沒有良好 的信號，那麼你就有可能看不到那個顆粒、無 法將它從旁邊的顆粒中區分出來，或無法確定 它的取向。

這些檢測器對 cryo-EM 研究領域的直接 影響離不開經過長期演變、與它並行發展起來的演算法。Carragher 指出，如果你很努力 地利用軟體開展研究工作，但是硬體又跟不 上，那就是徒勞。但是，如果硬體技術取 得突破進展，那麼軟體的作用就可以超常發 揮。1998 年，耶魯大學（Yale University） 的研究人員 Fred Sigworth 提出了一個基於 最大似然法（Maximum likelihood）的 EM 數據解析策略，即採用與「母結構（parent structure）」相關的取向概率來對每張 2D EM 圖像進行分類。作為馬德里國家生物技 術中心（Centro Nacional de Biotecnología in Madrid）Jose-Maria Carazo』s 小組裡 的一名博士後，Scheres 一直致力於擴展這 種方法，以重建 3D 蛋白結構，通過這種研 究策略，他們可以開展所謂的無監督分類法 （unsupervised classification）。Scheres 指 出，他們的實驗還表明，無需提前了解結構間 的實際差異，便可將所有數據劃分為不同的結 構狀態。現在，Scheres 的這種方法已然成為 被人們廣泛使用的圖像分類演算法的基礎。

不得不提的是智能軟體，因為它幫助我們 解決了另一個 cryo-EM 問題：電子束釋放的能 量導致的蛋白運動，這種運動會降低圖像的分 辨率。在採用直接電子檢測器原型開展研究工 作後，Grigorieff 提出了一個新演算法，也即利 用視頻數據格式來解析顆粒的運動情況。現在 這種方法已經成為了單顆粒 cryo-EM 技術的常 規方法。Grigorieff 表示，這種策略不但有助 於我們比對多幀電影圖片，還能消除可能會發 生的圖像模糊現象。他還引用另一位實現這些 分析技術飛躍發展的無名英雄的話：獲取低成 本，但強大的處理能力。你可能不相信，但是 促進這種飛躍的原因竟是遊戲產業，因為這個 產業使消費級別的電腦可以處理越來越大的數 據集。1997 年時只有最大的數據中心才能進 行的數據處理工作，到 2008 年人們在家裡的 個人電腦上便可實現。

運動的蛋白顆粒

Cryo-EM 技術取得的進展極大地鼓舞了 該領域的研究人員。隨著直接電子檢測器在 2012 年投放市場，cryo-EM 技術便開始以 驚人的速度取得一次又一次的成功。核糖 體是一個大型而又為人熟知的結構，同時它 也是 cryo-EM 領域的重要的基礎研究項目。 早期對核糖體的研究已經顯示出 cryo-EM 技 術的強大威力。研究人員並非簡單地將數 以百萬計的顆粒拼湊成 10 ?的結構，而是 通過研究不到 50000 個顆粒，直接以近原子 解析度解析蛋白。MRC LMB 的 Scheres 和 Venki Ramakrishnan 共同工作，最終解析了 解析度為 3.2 ?的酵母線粒體核糖體（yeast mitochondrial ribosome）大亞基結構；不到 一年，Scheres 又在人類整個線粒體核糖體上 做出了類似的壯舉。

研究人員發現高解析度的 cryo-EM 最適合 用於研究大型的蛋白質，但是小型蛋白呢？有 人質疑信噪比的降低和更頻繁的蛋白運動造 成的偽影是否會導致 cryo-EM 無法研究小型蛋 白。UCSF 的程亦凡是首位利用 cryo-EM 研究 500kDa 以下蛋白的研究人員。他以原子分辨 率解析了哺乳動物離子通道 TRPV1 的結構。 隨後，Scheres 學會了辨別由電子束導致的看 似不穩定的分子運動的不同模式。他表示，冰 里的蛋白顆粒往往與它們旁邊的顆粒有著同樣 的運動趨勢，我們可以通過這些信息更好地 預判它們的運動情況。這個發現讓 Scheres 和 清華大學的研究人員施一公一起得到了分辨 率為 3.4 ?的γ分泌酶複合物（γ-Secretase） 的電鏡結構。γ分泌酶複合物是一種阿爾茨海 默病（Alzheimer）相關酶，它的蛋白量僅為 170kDa。對此，Kühlbrandt 表示，這個成果 真是讓人難以置信。一年半前，Kühlbrandt 從 未想到居然能取得這種分子量大小的、蛋白分 辨率如此高的電鏡結構。

接下來，就是要解決解析度限制的問題 了。儘管大量的研究已證實 cryo-EM 的分辨 率能夠達到原子級別，但自從達到 3 ?解析度 後，基本上就沒有多少進一步的研究成果了。 Subramaniam 指出，直到去年 12 月，幾乎每 個人都認為 cryo-EM 有著不可逾越的限制。對 此，他和他的研究人員並沒有積極尋找新的 解決方法，而是回顧他們以前對β- 半乳糖苷 （β-galactosidase）開展的研究，試圖優化 該技術。最終，他們的努力得到了回報，獲得 了前所未有的平均解析度為 2.2 ?的蛋白電鏡 結構。Subramaniam 表示，他們系統地整理 每一個步驟。Subramaniam 還指出，之所以 能取得這個成果，只不過是因為他們不去理會 這種方法的限制，並且不斷摸索條件。

由於 cryo-EM 能夠統計大量的蛋白顆粒和 捕獲大群構象不同的蛋白顆粒，因此它在研 究蛋白動力學方面有著獨特的價值和意義。 Frank 的研究小組最近在原子水平上解析了延 伸因子 EF- G 催化核糖體異位的機制。Frank 指出，他們可以在樣品中看到兩個不同的結合 位點。他認為他們現在可以試圖解決過去想都 不敢想的問題了。多倫多病童醫院（Hospital for Sick Children）的 John Rubinstein 小組同 樣使用 cryo-EM 來捕獲 7 個不同構象的牛 ATP 酶。儘管解析度沒有達到原子級別，但是取得 的電鏡結構已經為重構這些酶的旋轉機制提供 了足夠多的細節了。Rubinstein 表示，他們試 圖觀察這些分子的運動軌跡，然後打算以高分 辨率解析它們的結構，從而探明這些分子是如 何形成更加動態的結構的。

「成長的煩惱」

興奮是具有傳染性的，尤其是對沮喪的結 構生物學家而言。Carazo 指出，現在想投身 於 EM 領域的研究人員簡直呈爆炸式增長。這 些研究人員手頭上都有想要使其結晶的樣品， 或者曾經將樣品交給晶體學家，但卻沒能從中 獲取有用的信息。

雖然這個領域慢慢火起來了，但質量控制 問題卻不得不重視。由於沒有非常精準的驗 證方法，所以圍繞數據解析有很多爭議。其 中一個最突出的例子就是 1,4,5- 三磷酸肌醇受 體 1（inositol 1,4,5-trisphosphate receptor 1, IP3R1）。據 Henderson 回憶，2002 年 -2006 年間共發表了三篇關於該受體的 cryo-EM 結構 的文章。而且這些結構都是各不相同的！不過 這些研究都是在直接電子檢測器問世之前開展 的，當時的技術解析度很低，並且背景雜訊很 嚴重。一旦圖像處理軟體將雜訊當做信號，那 么後續任何更進一步的數據解析工作都會出 現錯誤。Henderson 和他在 MRC 的同事 Peter Rosenthal 針對這個問題提出了解決方法—— 「tilt-pair 驗證（tilt-pair validation）」：收集 同一個待檢樣品的兩個不同取向的圖像，隨後 分別處理不同取向的圖像數據集，並對比兩組 數據，查看得出的比對結果能否反映已知的取 向差異。Rubinstein 指出，如果捕獲的圖像無 法重現樣品相對旋轉關係，那麼你的圖像可能 就是錯的。現在，這個問題已經沒那麼嚴重 了，因為我們可以在現代儀器中揭示精心準備 的樣品的清晰的二級結構了（即便不是氨基酸 側鏈），那麼這將能大大簡化數據解析工作。 不過，值得注意的是，這個過程還不能完全自 動化。Grigorieff 指出，要是出了什麼錯誤， 軟體可不會通知你。如果你只是使用軟體工具 而不考慮結果是否正確，你就有可能犯大錯。

數據共享將會是防止和糾正錯誤的另 11 一種方法。2002 年，歐洲生物信息研究所 （European Bioinformatics Institute, EBI） 構建了電子顯微技術數據銀行（Electron Microscopy Data Bank, EMDB），研究人 員可以往裡面存放他們的 3D 圖像數據，並且 許多研究論文如果想要獲得發表，就必須要 有存放在 EMDB 的相關數據。生物物理學會 （Biophysical Society）會長兼美國弗吉尼 亞大學（University of Virginia）研究人員的 Edward Egelman 進一步號召研究人員在提交 圖像數據時，一併提交經過審稿人審閱的論 文手稿，因為如果僅僅提供蛋白結構的圖像 是無法對其進行獨立驗證的。Rubinstein 贊同 Egelman 的做法，還表示，但很多人擔心這樣 會在論文發表前就泄露研究成果。另一邊廂， EBI 也構建了電子顯微技術試驗性圖像檔案庫 （Electron Microscopy Pilot Image Archive, EMPIAR），研究人員可以以自願為原則，存 放原始數據——可用於驗證新型分析演算法的有 價值的資源。

面對 cryo-EM 取得的成就，即便是經驗豐 富的研究人員，也會受其鼓舞，不畏艱難困阻 地想要採用最前沿的電子顯微鏡。目前該領域 的領軍者是 FEI 的 Titan Krios，這台顯微鏡身 價不菲，競達 500 萬美元，這可是許多研究機 構都無法承受的價格，而且這個價格還沒有算 上維護和操作的費用呢。Grigorieff 感概到， 什麼研究都沒做，你每年就要花費接近 50 萬 美元了（指使用這台顯微鏡）。集中型設施也 許是一個解決方法。在美國，一些機構，例如 珍利亞研究園區和美國國家自動分子顯微技術 資源網就允許研究人員預約使用高端的儀器； 而在歐洲，幾個國家已經構建起國家級機構， 例如英國的電子生物成像中心（electron Bio- Imaging Centre, eBIC）和荷蘭的納米顯微 技術中心（Centre for Electron Nanoscopy, NeCEN）。Krios 顯微鏡的精密技術使它可以 極大地提高數據採集速度，並可以預防出錯， 然而 Carragher 卻不認為每個研究機構都必須 配備 Krios 顯微鏡。她指出，只要大多數機構 配有性能良好的中檔設備，少數幾個中心配置 高端的儀器就是一個很好的解決方法。成本更 低的儀器可以讓我們初步了解蛋白結構，然後 判斷是否需要使用 Krios 獲得進一步的信息， 這樣性價比更高，Carragher 等人已經證明， 通過巧妙地使用中檔顯微鏡，就可以獲得分辨 率低至 3.7 ?的電鏡結構。

消除障礙

精簡成像過程是當務之急， 目前 NRAMM 正積極開發 cryo-EM 的自動化工具。 Carragher 指出，他們現在已落後於晶體學 家，晶體學家可以將樣品郵寄給光束線站，然 後由機器人自動完成相關工作。Carragher 還 表示，現在落後沒問題，但他無法想像到了某 個時期他們還無法實現技術的完全自動化。目 前 NRAMM 的研究人員已經開發出兩款軟體， 即 Leginon 和 Appion，它們可以部分實現圖像 收集和處理的自動化。然而，Cryo-EM 領域內 某些經驗豐富的研究人員仍然不願意太過依賴 自動化。Rubinstein 表示，目前完全自動化技 術產生的數據非常多，但其中高質量的數據卻 不夠多。

事實上，我們很容易就能獲得大規模的數 據量，因為使用者每天都能生產出百萬兆字 節的 cryo-EM 錄像。鑒於目前硬碟的容量已經 越來越大，數據儲存倒不是問題，而數據處 理才是問題所在，因為它有瓶頸期。Frank 指 出，即便現在我們已有功能強大的計算機集群 系統，但是要處理大規模的數據，還是需要非 常多的計算時間。此時，遊戲產業也許能再次 拔刀相助，因為該產業內的科研人員已經學會 有效利用高端圖像處理單元的強大功能了。 「雲技術」也可能是另一個選擇。哈佛大學 （Harvard University）的 Michael Cianfrocco 和 Andres Leschziner 已通過採用 Amazon 的 EC2 商業基礎設施成功將分析費用降低到 1500 美元 / 蛋白。

CRISPER 技術和高質量圖像將有助於進 一步減少構成最終結構圖像的蛋白顆粒的數 13 量。1995 年，Henderson 通過計算得知，理 論上每個人可以通過 10000-12000 個顆粒，而 不是數百萬個顆粒來解析原子解析度結構， 而這些年來的技術進步更加堅定了他的信心。 Henderson 認為，總有一天，我們將能通過 500-600 個顆粒來解析完整的結構。配備更加 靈敏、無雜訊的電子檢測器是進行相關研究的 必要條件。Scheres 強調，要想打造幾近完美 的檢測器就放手去做，其應該沒有物理極限。 Henderson 等人目前正朝這個方向努力，同時 他估計下一代檢測器將會在未來幾年內面世。 改進樣品製備技術也會有助於 cryo-EM 研究。 自 Dubochet 開拓性地改進了樣品製備技術以 來，該技術就停滯不前了。當時 Dubochet 將 蛋白樣品放在一個取樣載網上，然後用濾紙吸 干多餘的液體，隨後他們將載網和樣品一起凍 結，以開展後續研究。某些研究小組一直致力 於通過調整取樣載網的材料，以進一步提高樣 品的穩定性，或者試圖通過數量較少的蛋白來 製備實驗樣品。而其他小組則開發出一款新型 「相位板（phase plate）」。這塊板可以提 高圖像之間的信噪比。Carazo 指出，對於較 小的樣品來說，這樣可以使比對工作更方便易 行。

如果能通過數目較小的顆粒取得質量較高 的數據，那麼將能極大拓寬 cryo-EM 的作用， 這樣，研究人員不僅能成像較小蛋白結構的更 多細節，還能更有效地分析蛋白結構與功能之 間的關係。Frank 已經在往這個方向努力了， 他目前正在採用時間分辨 cryo-EM 技術來捕獲 核糖體翻譯過程中的稀少中間產物。Frank 表 示，他們確實已經發現了以前從來沒有被觀察 到的轉瞬即逝的狀態。Grigorieff 推測研究人 員將很快就能完成對細胞蛋白質組的廣泛的結 構篩查工作。Grigorieff 表示，過去，裂解細 胞並對其成像，然後用軟體技術在不同狀態下 重構不同的分子就是一個夢想而已，雖然現在 還沒能實現這個夢想，但也許這只是個技術問 題，如果真的是技術問題，那麼總有一天能實現。

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