蛋白互動圖譜有助闡明疾病原理

人類相互作用組：每一個點都是一個蛋白，每條線都是一個相互作用。

隨著蛋白質相互作用研究的深入，研究者們現在可以解構精細的細胞內機制。

1987 年，瑞士研究人員在論文中描述了兩個具有相似異常的姐妹。這對姐妹小腦中的一片組織缺失，並且心臟上有小孔和裂縫。其中一個女孩在 3 歲時接受了心臟手術後死亡，另一個在 4 歲時也接受了類似的手術，但倖存了下來。因為這對女孩的父母都沒有這些異常，研究人員得出結論，他們的女兒遺傳了一個非典型基因的兩個拷貝，導致患上以前未知的疾病。研究者們將這種疾病命名為 Ritscher–Schinzel 綜合征。

這對姐妹所患疾病的突變可能存在於單個基因中。然而，研究者們後來發現，其它幾種基因也與 Ritscher-Schinzel 綜合征相關。這些基因的功能以及它們與 Ritscher-Schinzel 綜合征的關聯多年來一直是一個謎。

現在，蛋白質 - 蛋白質相互作用得到了系統性研究，並逐漸成為焦點，相互作用組領域隨之興起。通過蛋白質之間的連接網路的不斷完善，三個研究團隊各自發現了一種由突變基因產生的蛋白質組成的、名為 Commander 的蛋白複合體。Commander 是細胞內的重要組成成分，負責對蛋白質進行分類和遞送，Commander 功能失調會導致 Ritscher-Schinzel 綜合征。

蛋白質等生物分子很少「單打獨鬥」；大部分時候它們在短暫的互動中彼此作用，或者組合在一起形成複雜的分子機器。蛋白質只有通過這種合作關係才能發揮功能。這些相互作用的破壞可能會影響人體健康。

德克薩斯大學奧斯汀分校（University of Texas at Austin）的系統生物學家 Edward Marcotte 指出，如果編碼一種蛋白質的基因發生突變，那麼由這種蛋白組成的複合物在某種程度上也會功能失調，最終引起疾病或癥狀。

生物化學家早就開始研究一種或幾種蛋白質與其它蛋白質相互作用的方式了。但現在，他們正在開發工具來系統地繪製從細胞器到生命體中的蛋白質 - 蛋白質相互作用的集合。通常，這些相互作用網路看起來就像星球爆發時的情景，蛋白質點或節點通過它們之間的相互作用彼此連接。這些網路中彼此作用的蛋白質可能代表關鍵複合體和共同功能，或，例如在 Ritscher-Schinzel 綜合征中，為疾病根源提供線索。

在過去三年，研究人員發表了第一個高質量的人類相互作用組圖譜。這些圖譜確定了約 93000 個獨特的蛋白質 - 蛋白質相互作用。

繪製這些圖譜的技術並不新鮮——蛋白質相互作用的繪製可追溯到 20 世紀 90 年代。自 21 世紀初以來，研究人員一直在測繪蛋白組相互作用。但是方法學的改進以及蛋白質純化、質譜和基因編輯技術的進步已經使研究人員能夠以更高的精度探索相互作用組，並研究蛋白質互動在疾病發生髮展中的作用。

然而捕獲所有的相互作用是一件非常困難的事情，因為組成複合體的蛋白質可能分布在不同的組織、細胞，甚至存在時間也有差異。當細胞對環境進行響應時，蛋白相互作用是一個動態過程，時而連接在一起，時而分開。映射完整的蛋白相互作用組可能需要新的方法和系統生物學的思維方式。

儘管如此，該領域已經取得了一系列成果。Marcotte 指出，雖然新的蛋白複合體層出不窮，但很多都被忽視了——這是互動組學圖譜上延伸出的基礎生物學。我們已經開啟了一扇新的大門。

數字遊戲

目前基本上有兩種構建蛋白互動映射的方法。酵母雙雜交測定法通過將基因表達與細胞中的蛋白質相互作用耦合，從而檢測蛋白質組之間的直接互動。第二種方法則通過抗體分離出複合物，然後通過質譜法鑒定複合物的組成部分（參看文後「選擇 A 或 B」和圖「圖譜繪製工具」）來將測定蛋白之間直接和間接的互動。

Marcotte 的實驗室使用第二種方法的改進版，即使用蔗糖密度梯度等生物化學方法分離蛋白質，以了解哪些分子傾向於保持在一起。

Marcotte 和他的實驗室的博士後研究員 Anna Mallam 基於得到的圖譜，對 Commander 蛋白複合體在細胞中的作用提出了假設。以前的研究表明，Commander 的兩個組分在結構上類似於構建和維持真核毛髮結構的蛋白質；其它成分似乎具有跨膜運輸蛋白質的作用。這些數據和其它研究結果表明，Commander 將特定蛋白從細胞膜移動到高爾基體，在那裡蛋白被回收利用。

最大的相互作用組學圖譜包含成千上萬的蛋白質，類似於星雲。通過解讀這些連接，研究人員發現了將癌症基因與「正常」基因區分開來的特徵，並確定了關鍵的生物過程的特徵，如細胞分裂過程中的染色體分離。

麻省波士頓 Dana-Farber 癌症研究所（Dana-Farber Cancer Institute）的計算生物學家 Katja Luck 也表示，即使採用多種方法，蛋白相互作用圖譜仍然很不完整。這是一個數字的問題。人類基因組包含大約 20000 個蛋白質編碼基因。如果假設每種蛋白質只有一種形式——事實上，很多蛋白存在多種形式——大約有 2 億種可能的相互作用。實際數量可能會小得多，因為許多互動是間接的；一對一的互動估計有 12 萬 -100 萬個。

從生化的角度來講，蛋白質是非常多樣化的，因此它們的相互作用無法被每個測定法平均地捕獲。例如，膜 - 蛋白質相互作用難以研究，因為當膜被剝離時，其形狀和行為都會發生變化；它們可能會和平時的配體分離。但是，這種不完整性對當前圖譜的影響尚不清楚。Luck 指出，他們剛剛開始理解不同方法的偏倚。

作為遺傳學家 Marc Vidal 實驗室的博士後研究員，Luck 已經改進了方法，消除了酵母雙雜交方法中的錯誤。酵母雙雜交法歷史非常悠久，可以追溯到 1989 年。Luck 指出，他們有做一些調整，以提高檢測的準確性。通過用條形碼標記蛋白質基因，團隊可以在大範圍的生長酵母中一次測試多個相互作用。嚴格關注細節、關鍵步驟自動化，以及 4 次測序，使他們能夠識別 6 萬個以上的相互作用，其中大部分是以前未知的。

該數據集構成了人類蛋白質相互作用組參考圖譜（Human Reference Protein Interactome Mapping Project）的一大部分結果，而且這個數據集還在不斷增長。Vidal 表示，到 2020 年，他們可能需要一些可以作為參考的相互作用組學圖譜。事情並不會總是一帆風順。相互作用組領域在早期產生了一些錯誤的網路。根據 2006 年的一篇綜述，只有約 3% 的、確定的相互作用得到了多種方法的支持。Vidal 認為，儘管人們對使用這些數據集非常謹慎。但十年來，我們還是取得了非常驚人的進步。

更好的映射與 CRISPR

Vidal 的最終的參考圖譜可能只是所有蛋白質相互作用組的一個子集。細胞和組織的變化以及細胞反應的變化，導致最後得到的互動組學圖譜可能有多個版本。德國馬普生物化學研究所（Max Planck Institute of Biochemistry）的生物化學家 Matthias Mann 認為，測繪這些變化是一件非常艱巨的事情。但他看好基因編輯技術（如 CRISPR-Cas9）的潛力。

Mann 的測繪方法包括建立表達數百種蛋白質的細胞系庫，並使用名為 Orbitrap 的超高分辨質譜儀進行相互作用測試。誘餌蛋白與綠色熒光蛋白融合在一起，產生光度分布，從而得以讓研究人員通過活細胞成像量化相互作用。Mann 指出，在 2009 年左右，創建細胞資料庫非常費力，CRISPR 技術大大簡化了這一流程。

自從 2010 年推出量化方法以來，Mann 的團隊已經繪製和量化了超過 28000 個互動。兩個互動蛋白以一對一比例存在時，被認為是「強」互動，並且可能存在於穩定和豐富的複合物中。Mann 表示，如果沒有這樣的信息，我們很難解析互動網路的結構。他的團隊發現，人類互動體系由弱關聯所主導，這可能提示，低丰度調節蛋白作用於更為穩定的蛋白。

細微的調整

整個領域的一個共同趨勢是採用相對溫和的樣品製備方法，旨在真實地捕獲細胞中的所有蛋白質 - 蛋白質相互作用。

加利福尼亞州生命科學公司 Thermo Fisher Scientific 的生物化學家 Rosa Viner 指出，他們正在努力尋找破壞性更低的方法。該公司專註於改進樣品製備、工作流程和質譜技術，以幫助研究人員確定細胞中存在的相互作用。她補充：「這是最難的挑戰——找到清晰度最高的方法，同時又不引入實驗假象。」

這些實驗假象包括在檢測相互作用之前就離散開的蛋白質複合物。為了維持複合體的結構，Viner 與加州大學爾灣分校（University of California）的研究人員合作，在質譜分析之前，對複合物進行化學融合——一種被稱為交聯的方法。這種策略名為 QMIX（quantitation of multiplexed, isobaric-labelled crosslinked peptides，同位素標記交聯肽定量），通過整合交聯化合物與化學標記，穩定並跟蹤蛋白質複合物。

良好的分析應該要考慮任何給定方法的盲點問題。波士頓哈佛醫學院（Harvard Medical School）的細胞生物學家 Wade Harper 表示，有些類型的蛋白的相互作用研究起來非常困難。高通量分析的一個問題是，它會限制你對單個蛋白質的關注程度。這是因為這種分析傾向於對每個反應一視同仁，無法特別關注某些反應。

Harper 和他的同事 Steven Gygi 也在哈佛帶領一個團隊來微調研究方法。Harper 指出，他們團隊比較小，只有四到六人。他們每個月可以創建四百到五百個細胞系。Harper 等人由此創造了最大的、從單一流水線實現的人類蛋白質互動組學數據集。他們的圖譜名為 BioPlex，包括大約 12 萬個互動。

前路漫漫

要深入了解蛋白互動，研究人員必須深入研究細胞。

加拿大多倫多大學（University of Toronto）生物化學家 Anne-Claude Gingras 使用了一種名為 BioID 的技術。該技術基於蛋白彼此之間的距離對蛋白進行標記。帶有標記的目標蛋白質向附近的蛋白質添加了化學標籤，以表示它與其它蛋白髮生了相互作用。這就像握著蠟燭的小孩，走到哪裡，哪裡就會有光。

藉助 BioID，研究人員得到了圍繞目標蛋白質的鄰域圖譜。據 Gingras 解釋，鑒別蛋白質在細胞大環境（相比於幾個蛋白之間的小環境）中的情況，有助於理解該蛋白的功能。BioID 的另一個優點是可以跟蹤不能通過其它測定法檢測的蛋白質，例如難以分離的膜包埋蛋白質。Gingras 表示，他們和其他團隊研究了染色質上的蛋白質，繪製了中心體組織，並檢測了各種膜的相互作用。通過 BioID 技術，該小組在發育過程中發現了調節器官大小的信號通路中的新成分。

Harper 實驗室使用的是一種類似的方法——APEX。藉助 APEX，研究人員發現，名為抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase）的轉基因植物酶調控著目標蛋白標記其它蛋白的時間窗口，從而得到更弱，但更空間上更精確的信號。

測定手段的多樣化意味著由各種方法測繪得到的相互作用可以彼此印證。霍華德休斯醫學研究所珍利亞研究園區（Howard Hughes Medical Institute Janelia Research Campus）的細胞生物學家 Jennifer Lippincott-Schwartz 指出，如果我們要了解細胞如何工作，那麼將所有蛋白質之間的相互作用圖譜與細胞內的空間圖譜連接起來，至關重要。

細胞里有很多大結構或細胞器，它們全部漂浮在含有豐富蛋白質的細胞質中。要了解哪些蛋白質正在發生相互作用，以及為什麼發生相互作用，這要求研究人員深入了解細胞環境。

Lippincott-Schwartz 的實驗室開發了一種工具，以用於使用熒游標記顯現活細胞內的蛋白質。這些工具已經揭示了六個細胞器——內質網、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體和脂滴——的移動和相互作用 3D 模型。該團隊稱它為細胞器相互作用組。

Lippincott-Schwartz 表示，互動組學是細胞生物學家的「假說生成器」。 如果你發現一個已知的蛋白和其它你不知道功能的蛋白在互動，那麼你就該鑽研下去，提出假設，然後去驗證它。

隨著蛋白質互動圖譜越來越高精度，越來越完整，研究人員終於得以把假設付諸於實驗。

更多閱讀：選擇 A 或 B 兩種高通量的蛋白質相互作用的測定方法各有支持者，但事實上這兩種方法是互補的。在物理層面，要確定兩種蛋白質是否發生了相互作用，這需要藉助酵母雙雜交系統。該測定包括將編碼兩個被假設發生相互作用的蛋白的基因融合到酵母表達質粒的轉錄因子基因上，從而構成融合表達載體。只有當目標蛋白質相互作用，並結合活化關鍵基因時，這種菌株才能生長。對生長的酵母菌落進行測序，我們就可以反推出相互作用的兩種蛋白質。酵母雙雜交系統允許一次快速篩選許多蛋白質對，但必須進行進一步檢測來驗證相互作用：兩個蛋白質在酵母核中相互作用，並不意味著它們在其天然存在的細胞中也會相互作用。研究人員還可以通過質譜來檢測蛋白質複合物。質譜儀將複合體轉化為帶電粒子的雲層，並通過其質量識別碎片。在一種常見的方法中，質譜分析前會進行親和純化——研究人員用蛋白質「餌料」標記肽或蛋白質。通過這些標記，我們可以從細胞漿中回收誘餌蛋白，或者隨後進行質譜分析，以確定與這些「餌料」結合的蛋白。或者，研究人員可以從細胞中充分混合蛋白質，並通過一系列生物化學步驟進行分離，最後進行質譜分析。在這種方法中，一同被分離出來的蛋白質是相互作用的配偶體。基於質譜法的方法允許研究人員直接在含有天然蛋白質的細胞中進行研究，而不需要在酵母中進行研究。但問題是，並不是所有的複合體都可以在提取步驟中維持穩定。此外，這些方法無法區分直接的物理交互、間接交互和鬆散的結構。

原文檢索：

Marissa Fessenden. (2017) Protein maps chart the causes of disease. Nature, 549: 293-295.

張潔 / 編譯

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