靶向GPCR的單抗類藥物研發現狀

Activation of the Galpha subunit of a G-protein-coupled receptor

G蛋白偶聯受體簡介

(GPCR，G-protein-coupled receptors)在人體中有超過800種家族成員，其中包括370類以上的非嗅覺功能性受體。GPCR、G蛋白及下游信號通路的功能異常或突變的產生往往跟很多人類疾病相關，通過藥物對GPCR功能進行干預也已成功應用於諸多疾病的治療，如心血管疾病、內分泌學、神經系統和免疫系統的疾病。毫不意外，目前包括處方葯在內所有的獲批上市藥物中，約有40%通過作用於GPCR而發揮作用。GPCR信號可做用於細胞內的多條信號傳導途徑。相應的激活劑結合後，會導致GPCR發生構象變化從而通過異源三聚體的G蛋白影響下游信號。活化後的GPCR同G蛋白的結合會導致分子亞基中GDP與GTP的交換，以及G蛋白亞基的解離。Gα與Gβγ隨後會激活下游信號通路，導致胞內cAMP或鈣離子水平的改變、激活或抑制離子通道、激活其他一些級聯信號通路。GPCR信號的終止也存在多種機理，包括配體的解離、受體被特異性激酶磷酸化、β?arrestin的結合以及受體的內吞過程。

G蛋白偶聯受體參與眾多生理過程，包括但不限於下述作用。

感光：視紫紅質是一大類可以感光的G蛋白偶聯受體，它們可以將電磁輻射信號轉化成細胞內的化學信號，引導這一過程的反應稱為光致異構化(Photoisomerization)，具體細節為由視蛋白(Opsin)和輔因子視黃醛共價連接所構成的視紫紅質在光源的刺激下，分子內的視黃醛會發生異構化，從「11-順式」變成「全反式」，這個變化進一步引起視蛋白的構象變化從而激活與之偶聯的G蛋白，引發下游的信號傳遞過程。

嗅覺：鼻腔內的嗅上皮(Olfactory epithelium)和犁鼻器上分布有很多嗅覺受體，可以感知氣味分子。

行為和情緒的調節：哺乳動物的腦內有很多掌控行為和情緒的神經遞質對應的受體是G蛋白偶聯受體，包括血清素，多巴胺，γ-氨基丁酸和谷氨酸等。

免疫系統的調節：很多趨化因子通過G蛋白偶聯受體發揮作用，這些受體被統稱為趨化因子受體；其它屬於此類的G蛋白偶聯受體包括白介素受體(Interleukin receptor)和參與炎症與過敏反應的組胺受體(Histamine receptor)等。

自主神經系統的調節：在脊椎動物中，交感神經和副交感神經的活動都受到G蛋白偶聯受體信號通路的調節，它們控制著很多自律的生理功能，包括血壓，心跳，消化等。

細胞密度的調節：最近在盤基網柄菌中發現了一種含有脂質激酶活性的G蛋白偶聯受體，可以調控該種黏菌對細胞密度的感應。

維持穩態：如機體內水平衡的調節等。

Two-dimensional schematic of a generic GPCR set in a Lipid Raft

經典的GPCR分子由三部分構成，分別是胞外長度約10-600個氨基酸的N段結構域、7次跨膜的α螺旋結構域(TMDs)及胞內的C端區域。胞外區域的抗體表位主要包括N端結構域以及3個胞外的環狀區域(ECL1-3)。這些胞外區域可能以無固定結構的可變柔性區域存在，也可能形成固定的二級結構；同時還伴隨著高頻率的糖基化現象發生。GPCR的胞外Loop大小不一，分布範圍在5-170個氨基酸之內。在很多種GPCR成員中，存在一個高度保守的二硫鍵，從而將α螺旋3的頂部同ECL2連接在一起。N端結構域則隨著超家族的不同而變化巨大。

已開發的靶向於GPCR分子的藥物主要是小分子藥物及低分子量的多肽類藥物。然而，考慮到單克隆抗體藥物相比於小分子藥物的諸多好處，以及獲得某些靶向於特定GPCR小分子藥物的困難性，醫藥工業界對於靶向於GPCR分子的單克隆抗體類藥物的研發興趣日益增加。

單抗類藥物在靶向GPCR中的優勢

Potential mAb interactions with a GPCR

儘管GPCR家族在所有成藥性靶點中佔比最大，但仍有四分之三的GPCR成員尚未被開發成藥物靶點；目前只有約80種GPCR分子具有相對應的小分子藥物，近30種GPCR分子相應藥物為多肽分子，通常與人體內自然存在的配體相關。針對GPCR靶點的藥物開發主要受困於尋找到具有合適選擇性以及類藥物性質的分子。對於小分子藥物而言，其通常結合在配體結合的保守位點，因而對於相近的受體成員間的選擇性較差；而抗體則具有很高的特異性，還可靶向於非保守的位點區域。另外，對於高通量篩選而獲得的小分子化合物，往往還存在因高度親脂性及分子量特點所帶來的藥物脫靶毒性。

相比於小分子藥物，單克隆抗體類藥物具有以下優點：具有更佳的特異性、用藥頻率優勢以及能夠有限制的滲透入中樞神經系統，從而有潛力作用於小分子在體內接觸不到的靶點。除此之外，單抗類藥物在不同患者個體間的葯代動力學差異很小；並可通過人源化方式去除潛在的T細胞抗原表位，或者選擇合適的給葯途徑來降低免疫原性的風險。除了具有所需的選擇性、高度靶點親和力以及提升的血漿半衰期外，單抗類藥物還能通過抗體依賴的細胞毒性(ADCC)，補體依賴的細胞毒性(CDC)及抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)而殺死細胞。另外，單抗類藥物還存在不同形式，比如抗體片段、雙特異性及多特異性抗體以及抗體偶聯藥物(ADC)等。

除此之外，單抗類藥物相比於小分子及多肽類藥物還有其他一些優點。比如，CCR4特異性的單抗藥物mogamulizumab在CCR4拮抗劑缺失的情況下可通過消除惡性CCR4陽性的T細胞而發揮作用；目前尚不清楚採用小分子CCR4拮抗劑類藥物能否達到相似的治療效果。單抗類藥物作用於受體的胞外區域，可以穩定多種不同的分子構象；而小分子藥物只能作用於TMD結構域。總體上單抗類藥物可以通過多種方式改變GPCR信號，而其中一些同小分子藥物的作用機制完全不同。首先，單抗分子可以封閉天然配體在受體上的結合，或者結合於相同或者重疊的區域，或者作用於活性位點外的區域。其次，抗體有可能通過空間位阻而直接封閉掉配體進入結合位點的可能。第三，抗體的結合能夠穩定受體的非活化狀態，從而阻止對於G蛋白或其它信號傳導所必須的構象變化的發生。第四，抗體可以在天然配體缺失的情況下，通過穩定受體活化形式而激活信號通路。抗體可以通過降低激活劑的解離等級制，穩定激活劑結合的受體構象，從而增加信號的傳導。第六，抗體有可能引起受體的內吞，從而降低信號強度。第七，雙價抗體有望通過促進分子的二聚化而改變GPCR信號的傳導。以上作用機制如上圖所示。

最後，生物製品類藥物(單抗類藥物佔據了絕大多數)的總體失敗率遠小於小分子藥物：約有25%的進入臨床前研究的生物製品最終獲批上市，而對小分子藥物而言這一數字為7%。另外，在研發過程的任一階段，生物製品表現都要優於小分子藥物，並且具有更高的轉化率。

靶向GPCR的單抗類藥物應用領域

The landscape of GPCRs targeted by antibodies

GPCR成員可通過序列保守性而在人類基因組中加以確認；但仍有很多分子目前其相應的內源性配體未知，被稱為孤兒受體。儘管科學家們做了很多常來試圖確認這些受體的天然配體，迄今仍有127種受體尚處於孤兒狀態。GPCR家族中的孤兒受體具有很高的藥物靶點開發價值，因為他們中的很多同眾多疾病密切相關，如癌症、精神紊亂、糖尿病與肥胖以及各類炎症性疾病等。從另一個角度講，直接作用於孤兒GPCR的抗體是一種探索該類受體功能機理的很好的工具，有望闡明他們在疾病中的靶點性作用；同時也是在配體未知情況下，開發靶向於該類別受體藥物的一種有效方式。與功能相對應，靶向於GPCR分子的抗體類藥物有望在多個疾病治療領域發揮作用，目前佔比較大的仍是癌症、炎症性疾病及代謝性疾病三大類別。

靶向GPCR的單抗類藥物研發現狀

GPCR-targeting antibodies in clinical development

隨著單抗類藥物開發技術的進步，GPCR也成為該類別藥物開發的熱點，目前主要工作集中於腫瘤學、炎症性疾病、自體免疫性疾病及代謝性疾病；另外也有很多研發項目在感染性疾病、疼痛、偏頭疼和纖維化等領域開展。靶向於GPCR家族的單抗類藥物管線正吸引了越來越多的商業關注，進入了快速發展的軌道。目前至少有74個研發項目集中於37種GPCR分子上，共有57中單抗類藥物正處於發現及臨床前研究階段，而39種則已經進入了不同的臨床研發階段；各項數字相比於2010年有了巨大飛躍，部分在研藥物信息總結如下。

Mogamulizumab

Mogamulizumab

迄今為止，只有Mogamulizumab一種靶向於GPCR的單抗類藥物獲批上市。Mogamulizumab由日本協和發酵麒麟株式會社(Kyowa Hakko Kirin)研發，於2012年3月30日獲得日本PMDA批准上市並在日本市場銷售，商品名為Poteligeo。Mogamulizumab是一種靶向於CC趨化因子受體4 (CCR4)的人源化單克隆抗體，CCR4則是表達於調節T細胞和輔助T細胞上的G蛋白偶聯受體(GPCR)。該葯批准的適應症為CCR4陽性成人T細胞白血病、CCR陽性外周T細胞淋巴瘤和CCR4陽性皮膚T細胞淋巴瘤。Poteligeo是一種靜脈滴注用溶液，每瓶共5mL含20mg Mogamulizumab。推薦劑量為每次1mg/kg，每周一次，共8次。

潛力研發方向

伴隨著抗體開發技術及靶點生物學功能基礎研究的推進，抗體藥物的發現及開發過程也迎來了快速發展期。除了經典抗體藥物研發路線外，新技術平台基礎上的以下研發思路也值得重視：

Mechanism of ADC

抗體偶聯藥物(ADC)

抗體偶聯藥物佔據了所有單抗類藥物臨床研發管線的11%，如果只看針對腫瘤領域的研發管線，則佔比高達20%。近幾年，全球已掀起抗體藥物偶聯物(ADC)研發的熱潮。ADC類藥物被認為能夠更加高效和有效的治療腫瘤等疾病，在未來將成為治療疾病的重要手段。根據全球知名市場調研公司Research & Markets發布的一份報告，未來10年，ADC市場將經歷飛速發展。目前，FDA總共批准了3種ADC藥物(Mylotarg，Adcetris，Kadcyla)上市，其中Mylotarg於2010年從美國撤市。未來10年，預計將會有7-10個ADC新葯上市，2024年ADC市場將達到100億美元。

LGR5是第一個被用於ADC藥物靶向的GPCR成員，其他還包括一類新型人源化的靶向CXCR4的ADC類藥物，可輸送LCK抑製劑Dasatinib至人體T淋巴細胞用於選擇性的免疫抑制；以及通過AmbrX製備的靶向於CXCR4的ADC，可用於免疫性疾病及銀屑病的治療。近期還有一類可將基於Auristatin的微管抑製劑類藥物輸送至內皮素B受體的ADC正在開展臨床前測試，來觀察單獨給葯或同BRAF及MEK激酶小分子抑製劑聯用時對黑色素瘤的治療效果。實驗中發現，抑制BRAF或MEK的活力會增加內皮素B受體的表達量，從而可以提升該ADC藥物的抗腫瘤活性；目前該抗體已在黑色素瘤中開展一期臨床研究。另外，一種靶向於FZD7的ADC類藥物也已被Concortis公司列上研發管線。伴隨著GPCR作為靶點基礎生物學研究的深入，以及人類對於生物製劑及化學物靶點選擇性的掌控，將會逐步提高ADC類藥物的療效，並降低脫靶效應的影響。

Schematic overview of the different strategies used to generate bispecific antibodies (bsAbs)

雙特異性抗體

雙特異性抗體佔據了所有單抗類藥物臨床研發管線的9%，如果只看針對腫瘤領域的研發管線，則佔比提升至11%。迄今為止，總共有兩種雙特異性抗體獲批上市，1種處在三期臨床階段，12種處在二期臨床階段，41種則正在開展一期或一/二期臨床研究。對於腫瘤適應症而言，約有一半的雙特異性抗體靶向於腫瘤特異性抗原及CD3，從而引導T細胞至腫瘤細胞，而使其選擇性殺死腫瘤細胞。雙特異性抗體相比於小分子藥物，多肽類藥物及單純的單抗類藥物有優勢，並且能夠克服腫瘤細胞的多重耐藥性。預計未來的6-8年，將會有更多的雙特異性抗體類藥物獲得批准上市。

MCLA-158是一類靶向於LGR5及EGFR的雙特異性抗體，目前正開展針對結直腸癌的臨床前研究，並計劃於2017年底啟動臨床研究。該藥物採用了Merus公司的獨特技術開發，採用了兩種不同的作用機制：阻斷腫瘤幹細胞生長及存活的信號通路；召集並促進免疫因子細胞對於腫瘤幹細胞的直接殺傷作用，後者往往存在於實體瘤中並於腫瘤的複發及轉移密切相關。

A shark (left) and a camelid (middle) heavy-chain antibodyin comparison to a common antibody (right)

單域抗體

其他類別的抗體形式或蛋白支架類藥物同樣可用來靶向於GPCR分子。這些不同的抗體形式為探索GPCR分子的識別決定因子提供了多樣化的工具；並且當克服了免疫原性及葯代動力學的諸多問題後，有望開發成為新型藥物。納米抗體使用的單域抗體平台來自免疫羊駝和僅有重鏈的抗體庫。最小的抗體來源的結合結構為獨立的V型結構域。最新的研究發現，駱駝及軟骨魚類具有的高親和力的V型結構裝載於Fc等效性結構與上作為他們免疫系統的一部分。這些V型結構域在駱駝中稱之為VHH或納米抗體，而在鯊魚中則稱之為VNARs。駱駝中的納米抗體通常分子量為12-15kDa。除了用於GPCR結構研究外，一些靶向於GPCR的納米抗體也在藥物發現過程中脫穎而出。目前兩類分別靶向於CXCR2及CX3CR1的納米抗體已經進入了一期臨床研究階段，分別用於腫瘤及慢性腎病的治療；另有一類CXCR4-CD4雙特異性納米抗體用於阻斷艾滋病毒感染。

總結

作為一類重要的藥物靶點分子，GPCR在藥物開發領域吸引著越來越多的關注，特別是在單抗藥物開發領域。越來越多的臨床藥物實驗拓展至靶向GPCR的抗體藥物中。人類對於GPCR在腫瘤學中生物性質的認識，特別是腫瘤免疫學方面，已經極大推進了該領域靶向治療藥物的研發。新一代蛋白藥物開發策略的應用，如雙特異性抗體及抗體偶聯藥物等，也推動了該領域的前進。考慮到科研人員在通過突變或過表達受體方式在穩定受體分子領域取得的進展，儘管一些技術性的障礙依舊存在，但並非不可克服。以上基礎研究的進展，連同高通量篩選技術的進步、對GPCR結構的深入了解，及生物學/臨床學意義的闡釋，將會為靶向GPCR的抗體藥物發現及開發過程中遇到的技術性瓶頸的解決，打下堅實的基礎。

縮略詞：

ATL:adult T cell lymphoma

C5aR:C5a anaphylatoxin receptor

CB1:cannabinoid receptor 1

CCR:C-C chemokine receptor

CGRPR:calcitonin gene-related peptide receptor

CRTH2:chemoattractant receptor-homologous molecule expressed on T helper 2 cells

CX3CR1:CX3C chemokine receptor 1

CXCR:C-X-C chemokine receptor

EGFR:epidermal growth factor receptor

ELTD1:EGF，latrophilin and seven transmembrane domain-containing protein 1

FZD: Frizzled

GCGR:glucagon receptor

GLP1R:glucagon-like peptide 1 receptor

GPCR:G-protein-coupled receptor

GVHD:graft-versus-host disease

LGR:leucine-rich repeat-containing GPCR

NSCLC:non-small-cell lung cancer

PTCL:peripheral T cell lymphoma

RSPO3:R-spondin 3

S1PR3:sphingosine 1?phosphate receptor 3

SLE:systemic lupus erythematosus

T2DM:type 2 diabetes mellitus

參考文獻：

1.https://en.wikipedia.org/wiki/G_protein-coupled_receptor

2.Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. MAbs. 2010 (6):594-606.doi: 10.4161/mabs.2.6.13420.

3.Opportunities for therapeutic antibodies directed at G-protein-coupled receptors. Nat Rev Drug Discov. 2017 Sep； 16 (9):1-24. doi:10.1038/nrd.2017.91.

4.Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochem Soc Trans. 2016 Jun 15； 44(3):831-7. doi: 10.1042/BST20160028.

5.Development of therapeutic antibodies to G protein-coupled receptors and ion channels:Opportunities，challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacol Ther. 2017 Jan ；169 : 113-123. doi: 10.1016/j.pharmthera.2016.04.013

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