深度長文：為什麼CRISPR必須拿諾獎？（下）
Jerry發獃
德國藥物化學博士在讀，關注新葯研發領域
為了闡明CRISPR是諾獎級成果這一問題，筆者在上半篇文章中已經對CRISPR技術的基本概念和詳細發展過程做出了介紹，詳見：深度長文：為什麼CRISPR必須拿諾獎？（上）。下半篇文章將會著重介紹CRISPR技術在各個領域中的應用，並對相關上市公司進行簡單介紹。
IV
植物基因組編輯
2016年初，杜邦公司宣布要開發一種新型糯玉米的消息並沒有引起多少人注意。大家不知道的是，杜邦公司培育糯玉米的技術「CRISPR」正悄悄改變著整個育種行業。該公司運用CRISPR技術敲除了玉米中能夠編碼澱粉合成酶的糯質基因wx1，從而使玉米中直鏈澱粉的含量減少、支鏈澱粉的含量增加，以此增加玉米的粘性。
自生命誕生以來的幾十億年內，生命的演化過程一直遵循著達爾文的物種演化理論：通過隨機遺傳突變獲得生存、競爭和繁衍後代等方面的優勢。但從農耕文明開始人類就試圖改變外部世界，選擇性的培育更加優良的動植物。早期的農民通過隨機的品種或利用雜交獲得新品種，但這與自然進化過程類似，同樣依靠的是DNA的隨機突變。所以改良過程十分的緩慢，雖然經過了數千年進展卻非常的小。
二十世紀初孟德爾的工作為植物育種奠定了科學基礎，並且為育種提供了可預測的框架。二戰之後隨著生物技術的發展又出現了新的育種方式，例如用甲磺酸乙酯、硫酸二甲酯等致突變劑，或者利用電離輻射或者轉座子等手段來誘導形成DNA突變，生成新的農作物性狀。而現代育種學則更進一步，可以直接利用分子生物學手段對植物的基因組進行改造。比如通過基因重組向植物中引入特定基因形成轉基因農作物。
但基因重組技術具有自身的局限性，例如難以準確定位到基因組，或者進行基因的敲除或敲落。那麼如何準確定位基因組進行基因編輯呢？1996年約翰霍普金斯大學的Srinivasan Chandrasegaran課題組發現將具備基因組定位功能的鋅指蛋白 (Zinc finger protein) 和Fokl核酸內切酶連接在一起，形成了能夠對DNA精切定位和切割的工具。但該技術存在很多的問題，其用於基因組定位的鋅指蛋白可編程性較差，設計和合成過程非常漫長。而且加州的Sangamo公司牢牢地把控著該項技術的專利，因此極大的限制了該項技術的發展和應用。
十幾年之後出現了另一項編程性更強的基因組編輯技術TALEN，讓科學家們能夠快速、精準的對基因組進行編輯。TALEN在2011年被Nature Method評為當年的Method of the Year，然而TALEN僅僅風光了一兩年，就淹沒在了CRISPR洶湧浪濤之下。
CRISPR被應用於玉米育種(painting by Gregory Allen)
由於CRISPR技術的出現，科學家能夠以前所未有的精確度來操控農作物的基因組。其實CRISPR技術不只能夠讓育種專家更加便捷的獲得預期的作物性狀，還能被用於提高多種作物的抗病能力。CRISPR技術誕生短短几年內該技術就被應用於編輯小麥基因組，使其能夠抵抗白葉枯病，使玉米，大豆，土豆能夠抵抗除草劑。2014年，中國科學院的科學家運用CRISPR以及TALEN技術同時修改小麥Mlo基因的6個基因拷貝，使其能夠抵抗白粉病。越來越多的作物正收益與CRISPR技術，使其具有更頑強的生命力。
與此同時，CRISPR對植物生物學研究的推進作用也是巨大的。長久以來科學家一直通過觀察自然界存在的天然突變，或者通過人工誘導隨機突變來探究作物中基因的功能。而CRISPR卻能夠以更加快速，更加高效的方式在基因中引入突變，破壞基因的編碼區，誘導其產生功能異常的蛋白，以此探究基因的功能。除此之外，CRISPR還可用於靶向miRNA來激活或抑制特定植物基因的表達，或是基因的敲入、替換，甚至運用dCas9來調控植物基因轉錄等等。
V
動物基因組編輯
除了糧食作物，CRISPR技術也能夠對畜牧業產生深遠的影響，通過很小的基因組修飾會很大程度地提高養殖動物肉產量。而且與農作物中的應用類似，運用CRISPR技術可以很方便的同時修改動物多個基因，比如中國的科學家利用CRISPR同時修改肌肉生成抑制素基因MSTN和能夠控制毛髮生長的生長因子基因FGF5，同時提高了山羊的肉產量和毛髮質量。
雖然CRISPR編輯的動物能夠推動畜牧業的發展，但實驗動物研究領域卻能最好的體現CRISPR技術的無限潛力。無論是用於病理研究還是新葯評價，實驗動物都對於現代醫學有著極其重要的意義。而實驗動物研究最基礎，最重要的是獲得可靠的動物模型，以此才能模擬人類發病的外在表現形式和內在發病機制。
從上世紀初開始，小鼠就已成為生物醫學研究中最常用的哺乳動物模型，現今已有超過三萬種小鼠品系，用於從癌症到心血管疾病、失明等一系列疾病的研究。CRISPR技術的出現為小鼠模型的建立提供了高效，快速的技術手段。不僅適用於幾乎所有的小鼠品系，還能夠極大地縮短所需的時間，同時其成本也相對低廉，其成本僅為傳統基因工具的十分之一左右。
雖然小鼠動物模型的應用廣泛，但其仍具有一系列局限性。對於諸如囊性纖維化、帕金森、阿爾茨海默病等疾病，它們通常無法表現出疾病的特徵性癥狀，藥效評價中也可能出現非典型反應。這就讓實驗室研究向臨床試驗研究轉化變得異常艱難。CRISPR技術的出現使非人靈長類動物模型的建立變得更加高效。
雖然十幾年前就可以通過病毒將外源基因轉入猴子基因組內，但CRISPR技術出現以前科學家卻無法對猴子基因組進行編輯。在2014年初，南京大學模式動物研究所的黃行許將CRISPR注入單細胞胚胎，通過引入Ppar-γ和 Rag1 組合突變對食蟹猴的基因組進行精確的修飾，以此獲得了世界首隻基因敲除猴。
CRISPR-Cas9 Horse Baby；by MichaelCammer
除了老鼠與猴，由於CRISPR技術的出現豬也開始成為一種比較重要的動物模型。豬的解剖學結構與人有類似之處，器官大小與人類的相似，而且繁殖周期短、產仔數量多，所以也可以作為動物模型，但更加重要的是豬器官可能成為人類器官移植手術的重要來源。其實長久以來這一直是一些科學家的夢想，但由於技術的限制使它遙不可及。即使是人類之間的器官移植也可能會產生嚴重的免疫排斥反應，何況是異種之間移植。而且豬內源性反轉錄病毒(PERVs)的存在也是個很大的安全隱患。
CRISPR技術的出現使我們向豬器官成為人類器官移植來源的追尋之路邁進了一大步。之前的技術主要是通過向豬基因組轉移人的某些基因來逃避免疫排斥過激反應，但包括CRISPR在內的基因編輯技術能夠直接敲除引起免疫反應的基因，或者直接敲除PERVs基因。
2015年哈佛大學的GeorgeChurch和他的學生楊璐菡共同成立的eGenesis，希望運用CRISPR技術來實現豬人體器官移植的宏偉目標。同年他們便實現了運用CRISPR同時敲除豬基因組內PERVs基因的62個位點這一壯舉。之後他們又完成了另一項成就：獲得不含PERVs基因的小豬。他們首先在不觸發細胞凋亡的前提下大範圍敲出豬胚胎結締組織細胞基因組的PERVs基因，之後採用克隆技術將細胞核轉入豬卵細胞，發育形成胚胎之後移植入豬子宮內並成功產下豬仔。
雖然豬器官的應用未來還有很漫長的路要走，但CRISPR的無限潛力使我們更改更早的看到這一天的到來。因楊璐菡對醫療領域的貢獻，她入選了世界經濟論壇評出的2017年度「全球青年領袖。
除了醫療領域相關的應用，腦洞極大的GeorgeChurch也在進行一項知名度相當高的項目：復活猛獁象。兩頭在大約兩萬年至六萬年前死亡的兩頭猛獁象標本為其全基因組測序提供了可能。通過基因組分析可以得到猛獁象與現存的象的基因組變化，並發現了能夠編輯與體溫感知、皮膚和毛髮發育，脂肪組織生成等過程相關的蛋白的1668個基因差異。George組在2015年運用CRISPR技術成功將現代象的其中14個基因替換為猛獁象的基因，但替換所有基因無疑會使一項非常浩大的工程，而且修改完之後的大象細胞並不一定能夠克隆並發育成為胚胎。(GeorgeChurch前幾年出版了一本書詳細解釋了他的這一宏偉目標，此書腦洞極大，還包括如何合成人的「手性異構體』』等研究項目)。
復活猛獁象 By NBC
除了以上這些應用，科學家們也在利用CRISPR技術控制遺傳過程，修改子代的遺傳信息。這項技術被稱為Genedrive。在二倍體生物的有性繁殖過程中，後代從父母兩方分別獲得一組染色體拷貝，這也就意味著親代的基因 (selfish gene 除外) 有50%的可能性遺傳給後代。但運用Genedrive技術可以使遺傳信息傳遞方式改變。
主導這個項目的是GeorgeChurch (又是他) 組的Kevin Esvelt。這項技術的核心是基因的敲入，利用CRISPR技術對特定位點進行精確剪切並插入一段新的序列。而插入的該序列包含生成CRISPR基因編輯系統的的信息，所以它能夠自動的將自身拷貝到另一條染色體上，使子代的所有個體的染色體上都包含能夠編碼CRISPR系統的信息。
如果插入的序列不僅包含CRISPR信息，還包含其他信息，那麼該信息也能夠在子代快速擴散。比如利用Genedrive在蚊子基因組插入瘧原蟲抗性基因，理論上在一段時間後該區域內的所有蚊子將會全部攜帶瘧原蟲抗性基因。這會成為瘧疾疾病預防的重大進展。但很多科學家並沒有止步於此，他們設想的是在蚊子基因組插入雌性不育相關基因，使該基因在某些蚊子種群中像病毒一般快速傳播，導致該蚊子種群在此區域內快速滅絕。
這會是一項非常可怕的技術，在實驗室的實驗過程科學家也應該盡全力避免基因修飾過的蚊子擴散到外界。在釋放的過程中很難預料影響會擴散到多大的區域內，而且如果使某些區域內的蚊子快速滅絕，儘管有些科學家聲稱不會產生嚴重影響，但個人覺得對生態的影響會很難預料，生態系統不會像一些模型預測的那麼簡單。
除此之外，最重要的問題是如何預防該技術的惡意使用？Genedrive的設計並不十分困難，如果有人向蚊子的基因組中插入某些惡性基因，那麼該技術會立即變成Gene Bomb (基因炸彈)。如何安全的使用該技術將會是一個非常大的問題。
VI
疾病治療
多種動物模型的臨床前實驗研究已經證明了CRISPR在臨床前動物模型中的巨大潛力，也為疾病研究和藥物研發提供了重要的工具。但CRISPR技術能不能更加直接的被用來治療疾病呢？
2013年張鋒和GeorgeChurch實驗室證明CRISPR編輯人類細胞的可行性之後不到一年的時間，中科院上海生化與細胞生物學研究所的李勁松課題組就使用相同的基因編輯工具驗證其治療遺傳病的潛力。他們選擇了小鼠白內障遺傳疾病模型進行研究，試驗中的模型小鼠攜帶顯性突變的Crygc基因能夠產生變性的晶狀體蛋白而發生混濁導致白內障。結果CRISPR能從小鼠基因組的大約28億個鹼基對中找到並修復突變。
研究人員設計了針對突變Crygc基因的導向RNA並直接將導向RNA和Cas9注入雜合子的受精卵中，之後發現有1/3的新生小鼠白內障癥狀被治癒。而且治癒的小鼠可以通過生殖細胞將CRISPR-Cas9系統修復的Crygc基因傳遞到下一代。之後幾年科學家又用CRISPR治癒了小鼠的肌萎縮以及肝臟代謝相關疾病，並證明了該技術治療鐮狀細胞貧血症，血友病，囊性纖維化，重症聯合免疫缺陷等重大疾病的潛力。無論是核苷酸突變、缺失/增加，甚至是染色體異常CRISPR似乎都能勝任。
以上這些研究都為CRISPR技術直接應用於人類遺傳病治療提供了安全性和有效性的初步驗證。當然CRISPR的潛力遠不止用於治療遺傳病，科學家們還在嘗試用基因編輯來阻止人體細胞免遭病毒感染，實際上在此之前第一個基因編輯臨床試驗正是為了治療HIV感染。除了傳染病領域，癌症也是CRISPR技術應用的領域之一。
基因編輯 By Gloria Pizzilli
雖然基因編輯是一個非常強大的工具，但將動物實驗的成果轉化為臨床研究的勝利並不容易。過去幾十年基因治療所面臨的風風雨雨提醒我們醫學的進展遠比我們想像的艱難。科學家面臨的第一個問題是靶細胞的選擇，體細胞還是胚胎細胞？
通過修改單細胞胚胎，其發育之後所有細胞的基因組將會被改變，其後代所遺傳的基因組也將會被改變，動物模型的實驗也證明了該策略的可行性。但該方法面臨著這嚴重的倫理問題。於是體細胞就成了大多數科學家的第一選擇。體細胞的基因組修飾無法遺傳給後代從而減少了倫理問題，但體細胞的基因組編輯遠比生殖細胞論複雜的多，因此我們必須解決選擇體細胞做基因組編輯所帶來的新問題。
其中最大的問題是藥物的遞送問題。不同的疾病會影響不同的人體部位，比如亨廷頓氏舞蹈病主要影響腦內神經元，而鐮刀狀細胞貧血症則影響紅細胞，囊性纖維化則主要影響肺部。選擇可及性比較高的體內循環系統則是相對容易的方向。而循環系統的治療方式也有兩類：體內基因編輯(in vivo) 和體外基因編輯 (ex vivo)。相對而言，體外的基因編輯方式更加簡便，而且有利於質量控制。去年四川大學華西醫院的盧鈾團隊率先開展了世界首個CRISPR人體臨床試驗，敲除T細胞表面的明星分子PD-1。該團隊所採用的正是體外基因編輯的方式。
但並不是所有科學家的思路都與以上的方式相同，首先選擇採用體細胞的基因編輯。
2015年3月，5位學者在Nature聯名發表文章Don』t edit the human germ line (不要編輯人類生殖細胞，聽起來有點像三體監聽員回複葉文潔的三句不要回答)，呼籲科研工作者謹慎使用基因編輯工具編輯生殖細胞基因組。但僅一個月後，中山大學的黃軍就組的文章上線，報道了使用CRISPR技術編輯86個無活性人類胚胎，以期修改能夠導致地中海貧血的HBB基因。雖然實驗的結果並不理想，但由於倫理問題該文章在國際上引起了巨大爭議。很多人擔心如果CRISPR被用於修改人類胚胎基因組來預防遺傳病，那麼該技術將難以避免的被應用於修改非醫學相關的基因問題。儘管如此，黃軍就還是被Nature雜誌評選為當年的年度十大科學人物。
編輯人胚胎：誰在扮演上帝的角色？(創世紀壁畫 by 米開朗基羅)
由於該文章所引發的巨大爭議，同年美國、英國和中國在華盛頓聯合組織了人類基因組編輯國際峰會，對人類基因組編輯的安全問題、倫理問題和政府監管進行了討論。在這之後，胚胎基因編輯的倫理爭議似乎開始變得沒那麼激烈，2016年瑞典和英國成為了中國之外的，允許胚胎進行基因編輯的另外兩個國家。
由於技術越來越成熟，該領域的研究和文章也越來越多。截止目前共有8篇人類胚胎編輯的文章發表，而其中5篇是在過去兩個月內發表的。兩周前(9月22日) 黃軍就的另一篇文章上線，同樣是修飾HBB基因用於治療地中海貧血，但這一次使用的是克隆胚胎細胞，而且利用的是不具有剪切功能的CRISPR系統 (且攜帶胞苷脫氨酶)進行鹼基編輯，以修飾點突變。
毫無疑問運用CRISPR進行人胚胎基因組編輯能夠對人類疾病的預防產生巨大的影響，雖然現在的研究重點主要集中於體細胞基因組編輯，用以治療疾病，但隨著技術的不斷進步，CRISPR編輯生殖細胞的潛力會被進一步挖掘，倫理問題也可能因此得到比較好的解決。
VII
CRISPR相關生物技術公司
嗜熱鏈球菌能夠將乳糖轉化為乳酸，所以常用於奶製品行業。丹麥的Danisco公司首先證明了嗜熱鏈球菌含有的CRISPR序列的功能是細菌的適應性免疫，用以抵禦噬菌體入侵（見：深度長文：為什麼CRISPR必須拿諾獎？（上））。2011年杜邦公司收購了Danisco，並開始研究如何利用CRISPR抵抗噬菌體感染的嗜熱鏈球菌，更好的製造酸奶和乳酪。同年，Jennifer Doudna還在研究第一類CRISPR系統的時候，她就參與創立了Caribou Biosciences，希望運用CRISPR技術來簡化病毒檢測的過程。
Emmanuelle Charpentier在2012年也逐漸有了創立公司的想法。在Science文章上線的五個月後，她便與當時還在賽諾菲任高管的老友Rodger Novak以及另一位風險投資家的老友Shaun Foy討論CRISPR的商業潛力。一個月後Novak決定辭職共同創立一家新公司。之後三人開始積極尋找合作夥伴。
在與Jennifer交流之後他們計劃聯合George Church和張鋒共同創立這家公司，以期簡化之後可能存在的專利問題。但不幸的是，由於各種已知和未知的原因之後的商談極其不順利。在張鋒和Church文章發表的一年半以後，CRISPR技術已經越來越成熟，資本強烈期望介入，成立公司的需求也越來越迫切。
CRISPR專利聽證會；來源： Science
但在知識產權、學術信譽、地理因素、媒體報道、諾貝爾獎、商業回報等一系列因素的考量下，對CRISPR技術做出巨大貢獻的四個人不僅沒有團結一致，反而開始分崩離析、各自為政。Jennifer和Emma二人組的關係也不像從前那麼單純，變得越來越微妙。不僅個人的利益摻雜其中，加州大學、布羅德研究所、哈佛大學、麻省理工、維也納大學這幾個學術機構的利益之爭也讓局面越來越複雜。
在此之後，Emmanuelle Charpentier, Rodger Novak, Shaun Foy, 以及Chad Cowan共同成立了CRISPR Therapeutics。張鋒，George Church, Jennifer Doudna共同成立了Editas Medicine。Erik Sontheimer, Luciano Marraffini, Derrick Rossi和 Rodolphe Barrangou共同成立了Intellia Therapeutics。而之後入局的其他公司則需要向以上這幾家公司和布羅德研究所支付高昂的專利授權費。
在2014年關鍵專利授權給張鋒之後一個月，Jennifer離開了Editas，加入Intellia。
VIII
寫在最後
我想現在已經很難找到一個沒有聽說過CRISPR這個名詞的生物專業學生。短短几年內CRISPR技術已經為基礎科研領域，和包括醫療健康以及農業等與大眾生活更相關的領域的發展產生了巨大的推動作用。在科學的發展過程中，偶爾會有重大的進展出現，比如相對論，比如DNA雙螺旋，比如PCR技術，CRISPR雖然可能不能與以上的突破比肩，但其對科學發展的影響是毋庸置疑的。
Jennifer和Emma的工作為CRISPR作為基因編輯工具的誕生提供了基礎，而張鋒和Church兩人同時證明了CRISPR編輯哺乳動物細胞的巨大潛力。毫無疑問，這些人對於CRISPR技術的誕生與發展做出了重要貢獻。但如果沒有Jennifer，如果沒有Emma，或者沒有Church，沒有張鋒，CRISPR技術就不會出現了嗎？顯然不是(參見附錄的時間線)。
CRISPR能拿諾獎的實力爭議很小，但誰最後能夠拿到諾獎卻是個很大的謎團。科學界並不像人們想像的那樣單純，在利益和榮譽面前多數會變的不理性。在關於CRISPR的戰爭中，有人獲得了金錢，有人獲得了榮耀，有人開心，但也有人失落。
如果說CRISPR技術推動了科學的進展，使我們更加憧憬未來的美好生活，那麼關於CRISPR技術的利益之戰和榮譽之爭，卻更讓我們理解了人的本性。
CRISPR Me by Michele Tragakiss
附錄：CRISPR時間線
CRISPR的發現與其功能
1987年，日本大阪大學石野良純第一次發現了CRISPR序列。
1993年，西班牙阿利坎特大學Francisco Mojica第一個確定現今被稱為CRISPR的位點。
2000年，Francisco Mojica發現並報告了之前發現的該差別重複序列存在某些共同的特徵（他在與RuudJansen的通信中使用過CRISPR這一名詞，後者在2002年在文章中正式使用這一名詞）。
2005年，Francisco Mojica發現該序列與噬菌體基因組中的某些片段向匹配，並由此推測CRISPR屬於適應性免疫系統。另一課題組也在同期獨立報道了類似的研究(Pourcelet al., 2005)。
Cas9與PAM的發現
2005年5月，法國國家農業研究院（INRA）Alexander Bolotin,在研究嗜熱鏈球菌的過程中發現了一個與眾不同的CRISPR位點(Bolotin et al., 2005)，該CRISPR系統缺乏之前熟知的cas蛋白基因，而還有其他未報到過的新cas蛋白基因，其中之一正是編碼後來被命名為Cas9蛋白的cas基因。而且他發現，與病毒DNA匹配的間隔序列一端均含有一個相同序列PAM(protospacer adjacent motif)，PAM是CRISPR目標序列識別所必須的。
適應性免疫假說
2006年3月，美國國家生物技術信息中心Eugene Koonin通過計算分析直系同源蛋白，並提出了CRISPR級聯為基於插入噬菌體同源DNA到間隔序列的細菌免疫系統的假設，摒棄了之前關於Cas蛋白作為DNA修復系統的假設(Makarovaet al., 2006)。
適應性免疫功能的實驗驗證
2007年3月，Danisco公司Philippe Horvath試圖研究廣泛應用於奶製品工業的嗜熱鏈球菌對於噬菌體的反應。Horvath及其同事通過實驗發現CRISPR系統確實屬於適應性免疫：將新的噬菌體DNA片段整合入CRISPR，並用以抵抗該類噬菌體的下一次攻擊(Barrangou et al., 2007)。他們還發現Cas9可能是使入侵噬菌體失活過程中唯一必須的蛋白。
間隔序列被轉錄為嚮導RNA
2008年8月，荷蘭瓦赫寧根大學John van der Oost開始逐漸解析出CRISPR-Cas系統干擾噬菌體入侵的過程。Johnvan der Oost 及其同事發現來源於噬菌體的間隔序列能夠轉錄生產小RNA，成為CRISPR RNAs (crRNAs)，能夠引導Cas蛋白靶向目標基因(Brouns et al., 2008)。
CRISPR如何作用於DNA靶標
2008年12月，美國西北大學Luciano Marraffini 和 Erik Sontheimer發現系統作用的靶標是DNA而非RNA (Marraffini and Sontheimer, 2008)。由於人們一直以來都認為CRISPR和RNAi具有類似的機制，這一發現讓研究人員感到意外。Marraffini和 Sontheimer 表示該系統如果能夠轉移到非細菌系統中，將可能開發成為強大的工具 (需要注意的是有的CRISPR系統可以靶向RNA (Hale etal., 2009)。
Cas9 剪切目標DNA
2010年12月，加拿大拉瓦爾大學Sylvain Moineau及其同事發現可以靶向DNA並在精確位點（PAM上游三個核苷酸）引起雙鏈斷裂(Garneau et al., 2010)。他們同時確證Cas9是CRISPR-Cas9體系剪切過程所需的唯一蛋白、由單個蛋白（此處為Cas9蛋白）和crRNAs介導的干擾過程是第二類CRISPR系統的獨有特徵。
Cas9 系統中tracrRNA的發現
2011年3月， Emmanuelle Charpentier課題組完成CRISPR-Cas9系統介導干擾過程的機制解析的最後一塊拼圖。他們通過包含CRISPR-Cas9系統的產膿鏈球菌測序發現除了crRNA，尚存在第二個RNA，稱為tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA) (Deltcheva et al., 2011)。該RNA與crRNA形成雙鏈，並介導Cas9靶向DNA靶標。
CRISPR 系統可以在異種生物中起作用
2011年7月，立陶宛維爾紐斯大學,Virginijus Siksnys及其同事克隆了嗜熱球杆菌（含有第二類CRISPR系統）的整個CRISPR-Cas位點，並在大腸桿菌（不含有第二類CRISPR系統）中表達，並發現其能夠氣功質粒抗性(Sapranauskaset al., 2011)。以上實驗表明具有獨立的功能，而且第二類系統所需的組分都已發現。
Cas9介導的剪切過程解析
2012年9月，立陶宛維爾紐斯大學Virginijus Siksnys及其同事利用以上在大腸桿菌中表達的系統確證了Cas9的作用機制(Gasiunas et al., 2012)。他們確定了PAM的作用以及剪切位點，通過點突變發現RuvC結構域能夠剪切非互補鏈，而HNH結構域能夠剪切互補連。同時表明crRNA序列最少只需要20個核苷酸，更重要的是他們發現通過更改crRNA序列可以引導Cas9靶向對應的DNA位點。
2012年6月，美國加州大學伯克利分校Emmanuelle Charpentier和 Jennifer Doudna與Virginijus幾乎同時報道了相同的發現(Jinek et al., 2012，該文章提交時間晚於Gasiunas等人文章)。但他們發現crRNA與tracrRNA能夠融合形成一條RNA，簡化了該系統。同時他們報道了運用該系統對GFPDNA進行剪切。
應用CRISPR-Cas9 進行基因組編輯的驗證
2013年1月，哈佛-麻省理工布羅德研究所張鋒和哈佛大學George Church在同期的科學雜誌報道了運用CRISPR-Cas9系統成功進行真核細胞內的基因組編輯。他們的研究表明CRISPR-Cas9系統能夠剪切人類以及老鼠細胞內基因組的多個位點，並能引導同源重組修復。
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