宏基因組實驗的那些坑-16S擴增子建庫方法的各影響因素

微微碎碎念：關於擴增子建庫方法，小編之前牢騷了很多篇了~為啥？因為實在太多的坑了！！！

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可謂是實驗過程處處坑啊

如果說之前分享的幾篇文章，因為樣本數等諸多遺憾，結論還不夠堅實，那麼剛發表於Microbiome，影響因子高達8.4的這篇文章，說服力應該是足夠的了~ 與諸君攫取精華分享

參考文獻：Muinck E J D, Trosvik P, Gilfillan G D, et al. A novel ultra high-throughput 16S rRNA gene amplicon sequencing library preparation method for the Illumina HiSeq platform[J]. Microbiome, 2017, 5(1):68.

文章主題：利用模擬樣本和真實樣本，評估不同因素對16S擴增子測序的影響。

模擬樣本中含有等濃度的33種細菌的16S全長序列的構造質粒。

評估的因素包括：

（1）DNA提取方法

（2）樣本濃度

（3）PCR第一輪引物

（4）PCR第二輪引物

（5）PCR循環數

（6）目標菌的GC含量

（7）Miseq vs Hiseq

一句話結論：以上因素皆影響測序結果。。。。。。

如主成分分析圖所示： 不同的擴增引物（不同顏色標註）有明顯差別

又如GC圖所示，模擬樣本中GC含量越低的目標菌檢測出來的丰度越高。

再如下圖，樣本濃度的高低（三角符號和圓點符號）及PCR循環數的不同（不同顏色）結果皆有明顯區別

PCR循環數越多，結果中嵌合體比例越高

微微碎碎念：為啥小編總是念叨著標準化、標準化呢？因為宏基因組研究的實驗中有真的有這麼多坑啊~~~

試想一下，有這麼多因素影響實驗結果，假如我們沒有標準化的實驗方案的話，我們如何確保我們結果的可比性和可靠性？假如不重視這些看似不起眼的技術環節，先不提研究結果轉換為臨床的檢測方法了，也不說研究結果為他人所借鑒了，連自己組內的實驗重複都有問題啊。

宏基因組技術發展至今，研究者已經不缺數據了，網上有大把的數據可供下載。可是這些數據大家敢用嗎？不敢啊~因為壓根不了解這些數據產生的方法和技術細節，就沒法把這些數據和自己的結果比對。

沒有辦法為他人所用的數據，甚至沒有辦法為自己二次所用的數據，價值何在？？

希望大家共同思考，咱們怎麼能打破這一難關？ 共勉之~

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