工藝從小試到放大時kLa和kLaCO2分別是如何變化的，為什麼？

圖片來源：sartorius官網

細胞培養的小試工藝確定後，如何保證規模擴大後細胞生長、產品產量及質量的穩定性是一個新的考驗。簡單的說，工藝放大主要是保證細胞所處環境一致，其中良好的傳質是個重要的先決條件。為保證放大後傳質效果一樣，細胞培養工藝從小試轉移到中試甚至生產時，常依據一些參數進行放大，如P/V、Mixing time、kLa和kLaCO2等。

在上面提到的四個因素中，kLa和kLaCO2分別為體系中O2和CO2的傳質係數，即兩者的傳質效果。kLa，表徵氧氣從氣相進入到液相的速率，但由於氧氣在水中的低溶解度，氧氣傳質速率(OTR)一直是好氧微生物培養的重要參數。反應器中合適的kLa是工藝放大的關鍵，O2作為細胞的重要營養物質，影響細胞的正常生長及代謝，工業生產中一般將O2濃度控制在40%。

細胞培養過程中體系中會積累CO2，其主要來源於葡萄糖及氨基酸代謝，通常用pCO2 (mmHg)表示體系中CO2的累積量。不同細胞系的最佳pCO2均不同，當體系中CO2累積增加導致pCO2升高時不僅對細胞生長和蛋白產生影響，而且還會影響蛋白的質量如糖基化水平等。對此不同的學者均有研究，Gray等觀察到高水平的pCO2 (>105 mmHg)會對細胞生長及蛋白產量產生抑制；Kimura等就36-250 mmHg的pCO2對MT2-1-8 CHO細胞生長進行了研究，發現250 mmHg的pCO2下細胞的比生長速率降低了30%；Matthias Brunner等在研究pH，pO2和pCO2對細胞生長和關鍵質量的影響中發現，pH和pCO2交互作用對N-乙醯葡萄糖氨基、半乳糖基化、唾液酸化、岩藻糖化的影響顯著，pCO2對單抗電荷修飾(如天冬醯胺脫醯胺作用和天冬氨酸異構化)的影響顯著的。由此可知，如何避免體系中CO2的累積，工藝開發時如何移除CO2就需要著重進行考慮。與kLa類似，kLaCO2 (CO2的傳質係數)可以用來表徵體系中CO2的移除能力。

工藝開發階段體系中kLa和kLaCO2均可以達到要求，二者可以說是步調一致，但是隨著培養規模的擴大情形就有所改變。Naoki Matsunaga的團隊研究了不同培養規模反應器(80L，500L，2000L和10,000L)的O2供給與CO2移除能力，即kLa和kLaCO2，結果如下圖。

不同規模反應器中、不同VVM以及不同攪拌槳線速度時的kLa和kLaCO2(圖表來源參考文獻1)

從上圖中的FIG.4可以得出，隨著培養規模的擴大，kLa的呈增加的趨勢。同樣條件下，kLaCO2雖然也有所增加，但是沒有kLa增加的程度大，見上圖FIG.5。除上面測的kLa值外，觀察培養過程中O2的消耗也可以看出kLa是隨工藝放大的增加，見下表。表中80L、500L和2000L的細胞接種密度一致，均為2.0*105 cells/mL，DO控制也一致，且培養過程中細胞生長曲線類似。在其他條件相似的情況下，放大過程中耗氧量反而下降，從647L降低至297L，這表明隨培養規模的放大O2的傳質能力增加，即kLa隨培養規模增加而增加。

圖表來源參考文獻1

既然Naoki Matsunaga的研究表明，工藝從小試向中試轉移或從中試向生產轉移過程中，kLa和kLaCO2均是增加的。那麼工藝放大時可以不用考慮O2供給與CO2移除嗎，盡可放心的進行放大？實則不然。

雖然kLa和kLaCO2均是增加的，但是二者增加的比例是不同的，並且不同規模下kLa相同時kLaCO2也有較大區別。如果將上面的FIG.4和FIG.5中的b圖拿出來進行比較，就不難發現這點。

攪拌線速度相同時不同規模下的kLa和kLaCO2比較(圖表來源參考文獻1)

在上圖中，對相同的通氣條件下(vvm相同)500L和2000L的kLa和kLaCO2進行比較。反應器規模為500L時，其kLa為0.7h-1，而kLaCO2為0.3h-1；反應器規模為2000 L時，其kLa為0.7h-1，而kLaCO2為0.2h-1；即同等條件下，kLa和kLaCO2的差別較大，kLaCO2還不能達到kLa的一半。而且，當反應器規模不同時(500 L、2000 L)，kLa為0.7h-1時，500 L的kLaCO2為0.3h-1，2000L的kLaCO2為0.2h-1；即在放大時維持kLa相同時，kLaCO2也是隨著反應器規模擴大而降低的。

是什麼原因造成了放大時kLa增加，kLaCO2反而降低？可以從下面的模型中進行簡單理解，其中相關的數據並不準確。向反應器中通入純氧時，氣泡在上升過程中與培養基發生傳質，氣泡中的氧含量不斷降低。反應器規模越大，氣泡在培養基中的停留時間越長，則更多的氧氣從氣泡中進入培養基，氣泡的含氧量就越低，即反應器規模擴大時kLa會增加。

與O2相反的是，CO2的移除是從培養基中進入氣泡中，其傳質方向不同。同樣的底部通氣策略時(相同的vvm)，由於大反應器中的氧氣需求降低(反應器從80L到2000L，需氧量從647L降低至297L)，沒有同等比例的氣泡將反應器中多餘的CO2移除。並且，氣泡上升過程中CO2不是一直從液相傳質到氣相的，其分為兩個階段：傳質和平衡，最終氣泡中的CO2是一定的，不會隨著高度而增加。反應器規模擴大時kLaCO2反而降低。

由此可以得出，工藝放大時kLa會增加，kLaCO2反而降低。與小試相比，反應器放大時低kLaCO2導致CO2累積增加，pCO2增加。如下圖所示，5L、20L和5000L中的CO2含量隨著培養規模增加而增加。

圖表來源參考文獻2

CO2過量累積對細胞生長及蛋白質量均有不利影響，如何增加體系中的CO2的移除率，可以從反應器放大中缺失的通氧量入手。Naoki Matsunaga的研究中對不同vvm時的kLaCO2進行了測定，實驗表明增加vvm可以增加kLaCO2，即提高vvm可以加快移除CO2，從而控制體系的CO2含量在可授受範圍內。值得注意的是提高vvm時會伴隨著體系中泡沫數量，所以此時還應將泡沫情況考慮在內。

不同vvm時的kLaCO2值(圖表來源參考文獻1)

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！