全長轉錄組應用系列（三）：融合基因檢測

一

什麼是融合基因？

融合基因是指兩個或多個基因的編碼區首尾相連，置於同一套調控序列（包括啟動子、增強子、核糖體結合序列、終止子等）控制之下，構成的嵌合基因。

融合基因是由染色體重排產生的，包括染色體的易位，插入，顛倒，缺失等（圖1）。融合基因的產生改變了基因的蛋白編碼序列或調控序列，使得基因功能發生變化，對機體的影響較大。

圖1. 融合基因產生原因示意圖。箭頭為斷裂位點[1]。

二

融合基因的功能

在生物體內發生融合基因，可導致疾病的發生。融合基因在癌症中普遍存在，與癌症的發生髮展密切相關。

融合基因引發癌症的機制主要有以下幾點：

1.基因轉錄調控的失調：指的是染色體重排會使少數與癌症相關的基因擁有強的啟動子或增強子，或轉錄激活因子，使其異常表達（圖2左）；

2. 融合基因產生的嵌合體蛋白：融合基因可能會產生功能異常的嵌合體蛋白，使生物體紊亂（圖2右）；

3. 基因截短：融合基因可能會產生正常基因被截短，從而使得抑癌基因表達失活，蛋白功能丟失，引發癌症。

圖2. 融合基因引發癌症的機制[1]

目前發現發生融合基因的癌症有乳腺癌、白血病、淋巴瘤、前列腺癌等等，已有涉及到8607個基因的9928個基因融合事件被報道與腫瘤發生有關[2]。

三

融合基因的檢測方法

1

染色體顯帶技術（chromosomebanding）

染色體顯帶技術可以研究大部分染色體重排，只有少數染色體間相同帶型的置換無法鑒定。另外，該技術也有一些缺點，如需要活細胞，這就要求拿到腫瘤組織後要馬上送抵實驗室；某些腫瘤細胞在體外很難培養；某些基因組變異複雜的惡性腫瘤，顯帶結果難以從背景噪音中分辨。

1

熒光原位雜交

對已知的染色體重排設計探針，可以檢測融合位點，但無法發現新的染色體重排。

3

高通量晶元技術

比染色體顯帶技術通量高，可檢測全基因組範圍內的染色體重排事件，並且解析度更高。但同樣也是只能檢測已知的染色體重排事件。

4

高通量測序技術

高通量測序技術研究融合基因的解析度和通量比傳統方法高得多，並且可以在基因組和轉錄組水平上進行研究。目前最廣泛使用的是基於二代Illumina測序技術的短讀長測序方法來研究融合基因，演算法也在不斷改進。

但是基於讀長太短這個致命弱點，利用二代短序列來檢測融合基因還是存在一些問題：一是測序錯誤、基因組變異的存在使得比對錯誤，導致融合基因的檢測不準確；二是基因組重複序列導致的多重比對使得檢測結果不確定。

而利用三代全長轉錄組技術就可以輕鬆解決這個問題。因為三代全長轉錄組技術無需對RNA進行打斷拼接，可以直接獲得融合基因全長，輕鬆判斷融合位點，在融合基因分析方面的優勢非常突出。

下面我們通過一篇文章來看一下三代測序技術是如何應用到融合基因檢測上的。

文章題目：三代測序技術檢測新的前列腺癌融合基因RLN1-RLN2[3]

影響因子：3.754

該文章利用三代pacbio測序技術研究前列腺癌上皮細胞LNCaP的高度同源基因RLN1和RLN2的表達。與一般的全長轉錄組流程不同，本文從LNCaP細胞中提取全長cDNA後，利用NimbleGen定製NF1探針捕獲目標序列，然後對捕獲得到的cDNA構建2Kb長度文庫， PacBio RSII平台測序，每個文庫測2個SMRT Cell。因為文章的主要目的是研究RLN基因，因此這個目標區域捕獲+全長轉錄組測序的方法也是節約成本和降低生信分析複雜度的一個好方法。

作者將測序得到的CCS序列與RLN1和RLN2參考序列進行比對，發現了兩個RLN1和RLN2的融合轉錄本：RLN1-RLN2-1和RLN1-RLN2-2（圖3）。將這兩條融合轉錄本比對到人參考基因組GRCh38/hg38上，校正序列的測序錯誤。然後將二代Illumina測序短序列比對到融合轉錄本上來校正三代序列的錯誤，結果顯示比對結果非常好，證明了三代測序得到全長轉錄本的準確性。

圖3 三代測序檢測到的融合基因示意圖

對兩條新發現的融合轉錄本進行序列分析，在轉錄本RLN1-RLN2-2中發現了一個新的外顯子結構，生成一種新的RLN2的isoform，其編碼產生的RLN2蛋白包含了完整的功能結構域，但是缺失了信號肽序列，影響了蛋白的分泌（圖4）。結合qPCR和資料庫表達量數據分析融合基因表達的情況，RLN1-RLN2-2融合基因在LNCaP細胞中與RLN1共表達，並且受到雄性激素相反的調控作用。

圖4. RLN1-RLN2-2編碼的蛋白缺失了信號肽序列

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