NgAgo到底能幹什麼？韓國科學家最新進展或推進真相？

?韓國學者Jin-Soo Kim等在BioRxiv上傳的文章稱，DNA介導的NgAgo蛋白切割的是RNA，而不是DNA。

　　摘要：

　　在很多科學家表示不能重複韓春雨NgAgo剪切修飾DNA的工作後，曾經發表來信表示同樣無法做到的韓國科學家對NgAgo的進一步研究又有了新的進展。他們在1月20日以預印本的形式公布一篇論文，稱NgAgo可以作用於RNA。這一結果有什麼意義？其他質疑DNA編輯作用的科學家也看到了NgAgo降低基因表達的作用，但當時只發現不是作用與DNA，不知道是否作用RNA或者蛋白質。而韓國科學家得到RNA是NgAgo作用的靶物。另外，還有其他科學家在尋找作用於DNA的Ago家族的其他同源蛋白。韓春雨的研究在事實上刺激了新的研究。他的研究如何判定？諾維信公司的不肯言明的合作是什麼意思？《自然-生物技術》收到什麼新的材料、如何判定？還有待事件進一步發展。

　　DNA介導的NgAgo到底能不能實現基因組編輯？自河北科技大學副教授韓春雨及合作者去年5月率先在《自然-生物技術》（Nature Biotechnology）報告NgAgo-gDNA系統可能是具有巨大潛力的基因編輯工具以來，科學界關於NgAgo是否真的能夠進行基因組編輯的討論就沒有停止過。

　　1月20日，韓國的學者又報道了一篇關於NgAgo的研究。這篇貼在論文預印本網站BioRxiv的文章「利用NgAgo進行依賴DNA的RNA切割」（DNA-dependent RNA cleavage by the Natronobacterium gregoryi Argonaute）稱，DNA介導的NgAgo蛋白切割的是RNA，而不是DNA。

　　NgAgo蛋白切割的是RNA，而不是DNA？

　　文章顯示，韓國國立首爾大學的Jin-Soo Kim課題組通過體外生化實驗，發現NgAgo具有DNA依賴的RNA酶活性，並且他們還發現其與NgAgo結合的DNA（gODNs）序列必須與RNA反向互補，而正義DNA（sense DNA）序列則不能引導NgAgo切割靶RNA。也就是說，與NgAgo結合的DNA序列如果與RNA序列相同，則不能引導NgAgo切割靶RNA。

　　相反，Jin-Soo Kim等人在這個體外生化體系中沒有發現NgAgo有切割DNA的活性，這個結果不同於韓春雨之前發表在《自然-生物技術》的NgAgo具有DNA酶活性的結論。

　　去年8月8日，韓春雨在向質粒共享信息庫Addgene提交的詳細實驗法方法中，提到的EDTA（二價陽離子螯合劑）可能影響NgAgo活性的問題。在這篇論文中，Kim等提供了體外生化證據，但證明的是二價金屬離子對於NgAgo的RNA酶活性（而非DNA酶活性）是必須的。

　　文章作者還做了進一步的實驗，測出了gODNs的長度和序列對NgAgo切割RNA效率的影響。實驗表明，gODNs長度低於13個核苷酸（nt）則完全不能介導NgAgo的RNA酶活性，而鹼基錯配會影響NgAgo的酶活性，特別是第5-14nt（5』-3』方向）的鹼基最為關鍵。這些結果與Cas9的DNA酶活性相似，但有意思的是，作者發現NgAgo可以多次循環催化，而Cas9隻能使用一次。

　　Kim等人在BioRxiv上傳的論文目前還沒有細胞內的實驗結果。

　　幾周前，Jin-Soo Kim將文章提交給某學術期刊評審。「評審過程比預想的要長很多，」在給《知識分子》的回復說，Kim說。這是Kim第一次在bioRxiv上報告他們的工作。「24小時內，我們的文章在推特上被轉發大約有50多次。」Kim說。

　　或可解釋關於NgAgo的多個報道

　　Kim等人的這一研究有什麼意義呢？

　　北京大學生命科學學院研究員魏文勝表示，DNA介導的Argonaute切割RNA的研究之前已有報道，Jin-Soo Kim的這一研究如果得到證實，也不是第一次證實DNA介導切割RNA的Argonaute。

　　例如，2005年，美國洛克菲勒大學的Tomas Tushcl實驗室與Dinshaw J。 Patel實驗室證實，Ago家族的Aa-Ago具有DNA依賴的RNA內切酶活性，可以在55℃以DNA為介導切割靶RNA。2016年，美國加州大學伯克利分校的Jennifer Doudna實驗室發現，Mp-Ago在60℃也有以DNA為介導靶向切割RNA的特性。

　　「只是NgAgo那麼受關注，有必要確定它到底能夠做什麼。」魏文勝說。

　　之前有多個實驗室向《知識分子》表示，可以重複韓春雨論文中使用NgAgo以後GFP熒光衰減的實驗，但未能發現基因編輯現象。

　　2016年11月11日，南通大學劉東實驗室和復旦大學王永明實驗室在線發表在《細胞研究》（Cell Research）的研究結果表明，他們設計的NgAgo-gDNA系統並沒有在斑馬魚上表現出基因編輯的功能，而是敲低（knock down）對應的基因表達，從而引起斑馬魚眼睛的發育缺陷。

　　對於以上現象，「我們猜測，NgAgo可能切割的是RNA而不是DNA」，Jin-Soo Kim說。

　　接下來的研究結果支持了Jin-Soo Kim等人的猜測。Jin-Soo Kim的這篇文章稱，他們的實驗結果可以解釋這些現象，特別是在劉東的論文中發現NgAgo的三個突變體（D663A， D738A， and D663A/D738A）與野生型具有相同的表型，Kim等發現這三個突變體並不能影響NgAgo的酶活性，側面呼應了劉東等在斑馬魚體內的實驗結果。

　　「Kim今天發表的文章的關鍵內容，其實我們也預測到了，在我們的《細胞研究》的文章發表之前，我們就曾推測RNA是NgAgo-gDNA系統下調基因的原因之一，但是我們沒有拿到直接的證據。」劉東告訴《知識分子》。

　　劉東等人之前的研究還發現，即使介導DNA與mRNA的序列相同，也是存在基因下調活性的，只是活性比較低。Kim的結果只能解釋gODNs與RNA反向互補的情況。不過，這與Kim等人的發現並不矛盾，劉東說，他推測這可能是因為DNA介導的NgAgo還會與靶基因結合，抑制了目標DNA的轉錄造成的。

　　「我們的文章發出來以後，也覺得仍然有一些有趣的東西沒有研究清楚，所以我們也在進一步探索。」劉東說。

　　NgAgo基因編輯結果可重複性爭議

　　NgAgo屬於被稱為Argonaute的一類蛋白質，因為其存在於格氏嗜鹽鹼桿菌（Natronobacterium gregoryi）中而得名。這類蛋白質最早在1995年就報道，並發現它們在RNA干擾中發揮重要作用。在韓春雨等人的論文中， NgAgo被認為可以通過以DNA為嚮導，實現對靶基因的基因編輯。

　　2016年11月15日，北京大學魏文勝等20位國內外實驗室的負責人在學術期刊《蛋白質與細胞》（Protein&Cell）刊登來信，表示無法重複韓春雨的NgAgo實驗結果，對NgAgo能否進行基因組編輯提出疑問。

　　接下來的11月28日，本文作者Jin-Soo Kim等10位科學家在《自然-生物技術》發表了使用NgAgo無法檢測到基因組編輯效果的來信。

　　去年11月底，《自然-生物技術》表示，針對韓春雨等人NgAgo論文結果的調查將於2017年1月底之前完成，屆時將公布最新進展。

　　今年1月19日，《自然-生物技術》在回應澎湃新聞時表示，期刊獲得了與NgAgo系統可重複性相關的新數據，在決定是否採取進一步行動之前，還需要調查研究這些數據。

　　同一天，河北科技大學官網的一條新聞稱，NgAgo-gDNA基因編輯技術工具在諾維信公司的真菌表達系統中已經展現出潛力，諾維信公司與河北科技大學基因編輯技術研究中心在上述技術的合作研發和產業化應用方面簽署了合作協議。

　　據澎湃新聞報道，諾維信表示已經測試了該項技術，「看到了其可能有用的一些跡象，但目前仍處於非常初期的階段」，還需要大量的工作才能確定該項技術是否適用於他們的業務，但未回應是否重複韓春雨等人發表在《自然-生物技術》的論文結果。

　　韓春雨未對Kim等人貼在BioRxiv的這篇文章置評。

　　「到目前為止，還沒有證據證明（DNA介導的）NgAgo能夠進行基因組編輯，我指的是單鏈或雙鏈DNA的編輯，切割或修飾。」魏文勝說，對韓春雨等人利用NgAgo-gDNA編輯基因組的文章的質疑仍然存在。

　　「高（編者註：高峰為《自然-生物技術》發表NgAgo可用於基因組編輯文章的第一作者）等人可能觀察到了由於NgAgo的RNA酶活性導致的部分的基因下調。我希望我們的新論文能夠終結已有爭議，並推動對NgAgo和其它該家族蛋白的新的興趣點。」Jin-Soo Kim說。

　　參考資料：

　　1.http://biorxiv.org/content/early/2017/01/20/101923

　　2.http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/full/nbt.3753.html

　　3.http://link.springer.com/article/10.1007/s13238-016-0343-9

　　4.http://www.nature.com/cr/journal/v26/n12/full/cr2016134a.html

　　5.http://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_1605206

　　6.http://news.hebust.edu.cn/zhxw/81152.htm

　　7.http://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765（05）01475-9