Science：重磅！開發出解析度僅為一納米的熒光顯微鏡

2016年12月31日/生物谷BIOON/---光學顯微鏡的最高目標是改善這種方法的解析度以至於一個人能夠單個地區分彼此間挨得非常近的分子。如今，來自德國馬克斯-普朗克生物物理化學研究所的諾貝爾獎得主Stefan Hell和同事們實現了長期以來被認為是不可能實現的目標：他們開發出一種新的被稱作MINFLUX的熒光顯微鏡，從而首次允許利用光學手段區分彼此間相隔幾納米的分子。這種顯微鏡在解析度上要比常規的光學顯微鏡高出100倍，而且甚至超過迄今為止最好的超解析度光學顯微鏡--- Hell開發的STED和諾貝爾獎得主Eric Betzig描述的PALM/STORM ---高達20倍。對MINFLUX而言，Hell以一種全新的概念結合了STED和PALM/STORM的優勢。這一突破為科學家們在分子水平上研究生命如何發揮功能提供新的機會。相關研究結果於2016年12月22日在線發表在Science期刊上，論文標題為「Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes」。

Hell解釋道，「我們利用MINFLUX實現1納米的解析度，這是單個分子的直徑---在熒光顯微鏡中可能實現的最終解析度限制。我深信MINFLUX顯微鏡有潛力成為細胞生物學最為基礎的工具之一。基於此，在分子細節上繪製細胞圖譜和實時觀察它們內部快速發生的過程將是可能的。這可能能夠在我們了解活細胞中發生的分子過程方面引發變革。」

Hell長期以來深信利用經常使用的聚焦光線和常規透鏡，熒光顯微鏡解析度能夠增加到單分子水平。

事實上，物理學家Ernst Abbe在1873年提出光學顯微鏡的解析度限制在光的波長的一半，大約是200納米。100多年後，這種阿貝限制（Abbe limit）仍然是有效的。然而，Hell是第一個證實這種限制能夠被STED顯微鏡克服：他1994年想出這種方法，在5年後，實驗性地構建出這種STED顯微鏡。

STED以及5年後開發的PALM/STORM實際上達到大約20～30納米的解析度---大約比這種阿貝限制好10倍。由於開發這些超高解析度顯微鏡技術，Hell和Betzig一起在2014年獲得諾貝爾化學獎。

將STED和PALM/STORM的優勢結合在一起

STED和PALM/STORM通過一個接一個地開啟和關閉相鄰的熒光分子，這樣它們有序地發出熒光，從而將它們區分開來。然而，這兩種方法在一個關鍵點上存在差異：STED顯微鏡利用一種圓環形的激光束在樣品中的固定位置---除圓環中心之外的聚焦區域中的任何一個位置---上關閉分子熒光。它的優勢在於這種圓環形激光束精確地確定對應的熒光分子位於空間中的哪個點上。它的劣勢在於事實上，這種激光束並不足夠強，因而不能夠將發出的熒光局限在這種圓環中心的單個分子上。另一方面，就PALM/STORM而言，它能夠在分子水平上和在隨機的位置上進行開啟和關閉。它的優勢在於人們已能夠在單分子水平上進行檢測，但是它的劣勢在於人們並不能夠知道分子在空間中的精確位置。這些位置不得不通過在照相機上儘可能多收集熒光光子方能找出；獲得不到10納米的解析度需要50,000多個檢測到的光子。因此，人們不能夠實現分子水平（一納米）的解析度。

在一種新的概念中，Hell想要將這兩種方法的優勢獨特地結合在一起。「這個任務是微不足道的。但是，我的同事Francisco Balzarotti、Yvan Eilers和Klaus Gwosch在同我一起利用實驗實現這種想法上做了出色的工作。」

與PALM/STORM一樣，MINFLUX隨機地開啟和關閉單個分子。然而，與此同時，它們的精確位置可通過類似於STED中的圓環形激光束加以確定。不同於STED的是，這種圓環形激光束在MINFLUX中激發熒光產生。如果這個分子位於圓環表面上的話，它將發出熒光；如果它正好位於昏暗的圓環中心的話，它不會發光熒光，但是人們能夠發現它的精確位置。Balzarotti開發出一種聰明的演算法以至於這種位置能夠非常快速地和高精度地被確定出來。這位年輕的科學家解釋道，「利用這種演算法，探究圓環形激發光束的潛力是可能的。」獲得分子解析度圖片的Gwosch補充道，「這真是令人難以置信，我們首次能夠利用MINFLUX在幾納米尺度上區分細節。」

解析度提高100倍

除了實現分子解析度外，將STED和PALM/STORM結合在一起也提供另一種主要優勢：Hell聲稱，「相比而言，MINFLUX更加快速。鑒於它利用一種圓環形激光束工作，相比於PALM/STORM而言，在獲得每個分子最終的解析度上，它需要更低的光信號或者說更少的熒光光子。」人們已經能夠利用STED實時地記錄活細胞內部的影像。但是，正如Eilers所強調的那樣，如今，在一種時間解析度提高100倍的情形下追蹤細胞中的分子運動是可能的。他首次成功地利用MINFLUX以一種前所未有的時空解析度拍攝出活的大腸桿菌中分子運動的影像。Eilers說，「就速度而言，我們還沒有充分利用MINFLUX。」研究人員深信在未來，能夠研究活細胞中極其快速發生的變化，比如細胞納米機器的運動，或者蛋白摺疊。（生物谷 Bioon.com）

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Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes

Francisco Balzarotti, Yvan Eilers1,2,3,*, Klaus C. Gwosch1,2,3,*, Arvid H. Gynn?4, Volker Westphal1,2,3, Fernando D. Stefani5,6, Johan Elf4, Stefan W. Hell

doi:10.1126/science.aak9913