多位專家指導：如何提取和研究血液DNA，RNA與蛋白

血液是唯一與所有器官都有接觸的組織，攜帶著有關機體的大量寶貴信息。在理論上，檢測血液攜帶的 DNA、RNA、囊泡和細胞殘骸可以幫助人們診斷和監控各種疾病。

產前基因篩查是血液檢測的一個重要應用，通過分析孕婦血液中的胎兒DNA來鑒定染色體異常（比如唐氏綜合症）。此外，越來越多的研究者開始關注血液循環中的其他生物學指標，比如RNA、微囊泡和外泌體。

外泌體（Exosomes）發現於上世紀八十年代中期，直到近幾年才開始引起科學家們的注意。外泌體是機體絕大部分細胞都能分泌的一種小囊泡，直徑在30 至100nm之間。外泌體裝載的蛋白質、調控性microRNA、DNA片段和其他代謝物，可以反映相應組織的內部活動。過去在很長一段時間裡，人們曾將外泌體視為無用的碎屑。但現在研究者們意識到，外泌體在細胞之間起到了信使作用，而且與腫瘤轉移有關。

外泌體受到廣泛關注是因為它具有獨特的性質。外泌體中的大分子不會受到外界核酸酶和蛋白酶的破壞，也就是說其中的生物學指標在一段時間內比較穩定。此外，外泌體上的表面標誌物能夠體現它的細胞來源，人們可以在此基礎上進行特異性的富集，比如專門收集來自腫瘤的外泌體。外泌體還有一個明顯的優勢：它們只揭示活細胞的情況。因為只有活細胞才能分泌外泌體。研究者們可以通過外泌體來監控活細胞，無視那些因為藥物治療而瀕臨死亡的細胞。

微囊泡（Microvesicles）是從細胞表面被動分離出來的，一般比較大，直徑可達1,000 nm。不同類型的微囊泡持有不同的細胞信息，很可能需要特別的提取方案。近年來人們逐漸意識到，細胞外微囊泡對癌症的發展和複發起到了重要作用。華中科技大學的研究人員在Cancer Research雜誌上發表文章指出，微囊泡中的miRNA會推動造血細胞的白血病轉化。研究顯示，慢性粒細胞白血病（CML）K562細胞的微囊泡，能使正常造血幹細胞轉變為白血病樣細胞。

血液生物學指標的商業化檢測目前主要集中在癌症領域。也有許多學術研究者嘗試用這種方式改善其他疾病的檢測和診斷。不過，研究者們一直沒能在檢測方法上達成一致。「我們還處於探索階段，」美國轉化基因組研究所的Kendall Van Keuren-Jensen說。「大家都想實現監測方法的標準化，但現在還很難說什麼才是最好的方法。」

為了幫助大家更好的分離囊泡、提取RNA、存儲樣本和分析數據，The Scientist雜誌與多位專家學者探討了檢測不同血液生物學指標的策略，貢獻出了相應的注意事項和實驗技巧。

甲基化圖譜分析

表觀遺傳學修飾可以在不改變DNA序列的情況下調控基因的活性，對於人類發育、人類疾病和環境影響有深遠的意義，是近年來生命科學領域的一大研究熱點。DNA甲基化是最常見的一種表觀遺傳學修飾，廣泛參與了細胞對基因表達的控制，在細胞生長、細胞分化、細胞增殖和疾病狀態中起到了關鍵性的作用。

研究者：香港中文大學的盧煜明（Dennis Yuk-ming Lo）教授

盧煜明教授是分子生物學臨床應用專家，尤其致力於研究人體內血液的DNA和RNA。現為香港中文大學李嘉誠健康科學研究所所長、李嘉誠醫學講座教授兼化學病理學講座教授。他屢獲國際殊榮，包括2005年國家自然科學獎、2006年國際臨床化學和實驗室醫學聯合會—分子診斷學傑出貢獻獎、2006年美國國家臨床生物化學學院（NACB）傑出科學家獎、2006年裘槎基金會優秀醫學科研者獎、2007年美國臨床化學協會（AACC）SigiZiering獎、2012年AACC-NACB臨床化學傑出貢獻獎、2009年富布賴特香港傑出學者獎，以及2014年費薩爾國王國際醫學獎。盧教授亦於2011年被選為英國皇家學會院士，在2013年被選為美國國家科學院外籍院士。2015年獲美國臨床化學協會（AACC）頒授年度Wallace H. Coulter講學獎，是全世界首位獲獎的華人學者。

研究項目：根據血液中的甲基化DNA分析機體器官的狀態

背景：盧教授是無創產前診斷的奠基人，率先提出了在孕婦血液中檢測胎兒DNA的理論。「血液DNA本質上是來源於不同器官的DNA混合物，我希望能夠通過血液檢測來判斷機體不同部位的異常，」盧教授介紹道。

工作進展：為了解決多種組織在血液中的DNA貢獻，盧教授的研究團隊從十四種不同組織（包括肝臟，血細胞，胎盤等等）的甲基化組中挖掘出5,820個帶有足夠組織信息的甲基化生物標記。然後他們利用二次規劃法分析多維的方程組，求出關於各個組織在血液中貢獻的最優解。這就是生物信息學重迭解析處理（bioinformatics deconvolution process）方法。

研究人員發表在美國國家科學院院刊PNAS雜誌上的研究顯示，較低的測序覆蓋度也能分辨與移植器官和肝癌有關的甲基化模式。這種方法能夠給出可靠的信息，鑒定異常循環DNA的器官來源。舉例來說，研究人員在血液中檢測到了癌細胞基因組的拷貝數變異，並且根據相應的甲基化模式找到了這些變異的來源——肝臟腫瘤。

注意事項：研究血液甲基化組會面對許多未知因素，比如甲基化模式在個體間的變化，甲基化DNA片段在血液循環中的穩定性。盧教授團隊檢測的甲基化標記中大約15%在志願者之間有顯著差異。由於測序過程的重亞硫酸鹽轉化會破壞一些DNA並且產生偏好，單分子測序等更靈敏的方法對血液甲基化研究將更有幫助，盧教授指出。

前景展望：盧教授表示，分析血液中的組織特異性甲基化模式還會有更多的用途，比如追蹤移植排斥或者鑒定循環腫瘤DNA的來源。「當你不知道哪個器官出現異常的時候，這是一個很好的突破口。」

實際上，盧教授已經領導團隊在美國國家科學院院刊PNAS雜誌上發表了這方面的研究成果。他們通過分析血液中的甲基化DNA，檢測到了癌症患者的肝腫瘤和淋巴瘤，以及孕婦胎盤中的遺傳異常。這項工作在分子診斷與基於器官的傳統醫療之間搭起了一道橋樑。

外泌體蛋白

外泌體發現於上世紀八十年代中期，直到近幾年才開始引起科學家們的注意。外泌體是機體絕大部分細胞都能分泌的一種小囊泡，直徑在40-100nm之間。一些外泌體相當於膜形成的垃圾袋，是細胞清除特定大分子的一種途徑。另一些外泌體是細胞之間的一種通訊工具，能夠對細胞功能產生影響。

在過去很長一段時間裡，外泌體並沒有引起人們的注意。直到最近研究者們才逐漸意識到，外泌體所含的多種分子可以成為理想的生物學指標。外泌體內的大分子比較穩定，不會受到外界核酸酶和蛋白酶的破壞。外泌體的表面標誌物能夠體現它的細胞來源。而且外泌體只反映活細胞的內部情況。（更多詳細信息參見：外泌體的生物學指標及研究工具）

研究者：加州大學醫學和免疫學教授Edward Goetzl

研究項目：分析循環外泌體中的蛋白，開發阿爾茨海默症血液測試

背景：阿爾茨海默症（AD）是一種進程性的神經退行性疾病，俗稱為老年痴呆症。阿爾茨海默氏症患者的認知和記憶功能會不斷惡化，極大的影響其日常生活能力，這種疾病是老齡化社會面臨的一大難題。

目前醫生們主要通過臨床癥狀、大腦成像和腦脊液提取來診斷阿爾茨海默症。雖然這些診斷往往是正確的，但只有屍檢才能證實疾病標誌的存在：大腦中的β澱粉樣蛋白斑塊和tau錯誤摺疊形成的神經纖維纏結。源自神經元的外泌體含有細胞特異性的蛋白質和RNA。如果可以通過循環外泌體追蹤異常的β澱粉樣蛋白和tau蛋白，那麼定期血檢就可以用來監控阿爾茨海默症患者的疾病進程。

蛋白質檢測：Goetzl及其同事收集了阿爾茨海默症患者確診前後的血樣。他們先用System Biosciences公司的ExoQuick分離血樣中的所有外泌體，再用結合神經元表面蛋白的抗體富集神經元外泌體，檢測這些外泌體所含的蛋白質。研究顯示，在阿爾茨海默症患者的神經元外泌體中，tau、磷酸化tau和β澱粉樣蛋白的表達水平顯著較高。舉例來說，阿爾茨海默症神經元外泌體的磷酸化tau比對照多十倍。

研究人員指出，尋找正確的群體進行比較是非常關鍵的，因為許多老年人已經表現出認知衰退的跡象。這項研究募集的志願者不僅認知能力正常，而且沒有阿爾茨海默症家族史，也不具備已知的疾病風險因子。（Alzheimers Dement, 11:600-07, 2015）

注意事項：現在還不清楚血液中神經元外泌體的總量是否會隨著疾病狀態發生改變，因此我們應該適當處理數據，在單個外泌體水平上進行分析。此外，蛋白質從外泌體提取出來之後需要迅速分析，「外泌體把蛋白質保護得很好，一旦我們將蛋白質提取出來，它們就很容易降解，」Goetzl指出。

前景展望：2013年Goetzl與人合作建立了NanoSomiX公司，以開發阿爾茨海默症血液測試。「我們希望能夠提前10-15年鑒定到疾病風險，讓高風險人群使用預防性藥物，」他說。

Exosome Diagnostics公司去年開發了一種基於離心柱的簡便方法來分離外泌體，並提取出其中的RNA。研究人員在《PLoS ONE》上介紹了這種新方法。與超速離心相比，這種方法能分離出高純度的RNA，並且對囊泡RNA有著高的特異性。離心柱能夠容納4 mL樣本，實現了血清和血漿中低丰度轉錄本的檢測。目前，基於此技術的商業化產品 – exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit – 已由QIAGEN推出。

外泌體microRNA

研究者：Illinois大學副教授Neil Smalheiser

研究項目：從血漿外泌體鑒定阿爾茨海默症的miRNA指標

研究背景：外泌體與其他囊泡的區別主要在於尺寸、浮力密度、形成機制和特定細胞內指標。MicroRNA（miRNA）是長約22nt的非編碼RNA，這些小RNA在天然細胞中大量存在，它們能與靶基因的mRNA配對，在轉錄後水平上調控目標基因的表達。大量研究表明，microRNA控制著胚胎髮育、細胞分化、器官生成等重要的生物學過程，對於正常發育、細胞生長和生物行為非常關鍵，而且與複雜的神經退行性疾病有關。近來不少研究者發現，阿爾茨海默症患者的大腦組織和血液都存在miRNA水平的改變。

檢測miRNA：Smalheiser團隊使用了分離外泌體的傳統方法——差速離心（differential ultracentrifugation）。他們用這種方法逐漸洗掉游離RNA、蛋白聚合物和細胞殘骸，只留下外泌體。隨後研究人員從外泌體提取RNA並對其進行測序，建立了成熟miRNA的數據集。他們通過計算模型鑒定了一組可以將阿爾茨海默症和對照準確分開的miRNA。

不過，超速離心速度較慢，也無法實現高通量。此外，超速離心中有許多變數需要標準化（例如轉子的選擇和離心條件等等），很難轉化到臨床中去。好在，市場上出現了多款方便的試劑盒。比如，賽默飛世爾科技推出了幾款總外泌體提取試劑盒（Total Exosome Isolation Reagent），能夠分別從細胞培養基、血清、血漿、尿液及其他體液中分離出完整的外泌體。

實驗技巧：研究人員使用的離心方法使他們能夠獲得相對純凈的外泌體，Smalheiser指出。在用Trizol試劑提取RNA的時候，他的團隊發現添加糖原使產量提升了將近23%，這一步驟可以用於其它低產量RNA。

在實驗室中，RNA提取過程的痛苦是眾所周知的。RNA極其脆弱，對RNAses酶的降解非常敏感，而這種酶幾乎無處不在。美國佛羅里達大學的研究人員為此開發了一種新的RNA提取方法，並將其發布在《Applications in Plant Sciences》上。他們將Trizol試劑、Turbo DNA試劑盒（由Life Technologies Ambion生產）和自己開發的步驟結合起來，讓RNA提取變得更迅速、更有效、更可靠。

細胞外RNA

研究者：加州大學聖地亞哥分校副教授Louise Laurent，美國轉化基因組研究所副教授Kendall Van Keuren-Jensen

研究項目：鑒定胎盤功能障礙（Laurent）和大腦損傷（Keuren-Jensen）的循環miRNA指標

研究背景：近年來，人們在血漿或血清樣本中成功檢測到了疾病相關的RNA（exRNA）。這些細胞外RNA可以成為非侵入性的疾病診斷指標，這是RNA檢測最有前景的發展方向之一。在多種細胞受到破壞的疾病中（比如大腦損傷），循環miRNA是非常重要的生物學指標。研究這些miRNA的團隊很多，可供選擇的實驗方案也不少，不過研究者們還沒有就此達成一致。Laurent和Keuren-Jensen都是美國NIH細胞外RNA交流協會的成員，他們正在努力推動循環miRNA檢測的標準化，提升細胞外RNA研究的可重複性。

胎盤囊泡：在妊娠期間，胎盤會將包含RNA的囊泡釋放到母體血液中。Laurent希望從中鑒定胎盤疾病的miRNA指標，比如子癇前期和宮內生長受限。她和同事正在優化自己開發的方法，從外泌體和微囊泡提取miRNA並分析相關數據。初步研究結果顯示，母體血液中的外泌體和微囊泡都可以分離出妊娠特異性miRNA。妊娠後期的miRNA指標與胎盤組織的關係尤為密切。

大腦撞擊：Van Keuren-Jensen團隊將監控撞擊數據的感應器裝在橄欖球運動員的頭盔中，並在橄欖球賽季中收集運動員的血液、尿液和唾液樣本。他們對這些樣本進行RNA測序，尋找與撞擊數據有關的生物學指標。研究人員使用了一系列商業化試劑盒，並且對細胞外RNA收集方法進行了比較。「使用不同的試劑盒或分離方法會造成很大的差異，」Van Keuren-Jensen說。「現在還很難斷言哪種試劑盒最好。」

注意事項：有些測序試劑盒使用帶「粘性」末端的短片段DNA來結合要擴增的目標分子。這些末端（被稱為接頭）可能給實驗結果帶來很大的變數。有些試劑盒產生的接頭二聚體比較少，但測序偏好比較大。有些試劑盒提供的接頭更隨機化，可能與某些miRNA結合得更好。「這些因素會使結果產生較大差異，導致難以重複的結果，」Van Keuren-Jensen說。

實驗技巧：Laurent指出，減少樣本批次、盡量由同一個人操作有助於降低結果的差異性。使用內參（比如不受疾病影響的一種RNA）是提高結果可重複性得另一條途徑。在沒有一個通用標準的情況下，「設立內參可以幫你去除產量或批次差異帶來的許多影響，」Laurent說。Van Keuren-Jensen建議大家在論文中分享自己所用的試劑盒和分離方法，因為這些信息對實驗結果的重複很有幫助。

監控exRNA只需要採集血樣，不像腫瘤活檢那麼有風險，成本也比較低。不過從血漿或血清中分離exRNA仍有一定的挑戰性，一方面是因為exRNA丰度低，另一方面是因為血液中的污染物會抑制PCR。商品化的試劑盒能簡化和加速exRNA提取過程，已成為循環exRNA研究不可缺少的工具。然而很少有人橫向評估這些試劑盒的提取效率如何，是否能去除血漿中的污染物，是否會偏向特定的RNA。而這類評估對於結果解釋和實驗之間的比較都很關鍵。

於是，美國愛因斯坦醫學院的研究人員評估了市場上7種常用的exRNA提取試劑盒，分別來自貝克曼?庫爾特、Life Technologies、Exiqon、Zymo、QIAGEN公司。他們具體評估了合成RNA的總體回收率、不同大小的合成RNA的回收能力、exRNA產量和純度，以及純化後的擴增效率。研究結果發表在《BioTechniques》雜誌上。

早期非小細胞肺癌（NSCLC）是無癥狀的，並且很難檢測到，因為目前沒有可用的NSCLC血液測試。最近，在Cell子刊《EBioMedicine》發表的一項研究中，南京大學生命科學學院的張辰宇教授和南京大學附屬金陵醫院的張春妮教授帶領的研究小組，確定了一組（五個）血清microRNA（miRNA），作為NSCLC診斷的潛在生物標誌物。

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