揭開NgAgo技術之謎：NgAgo基因敲減功能詳解

作者：子非魚（轉載請註：解螺旋·醫生科研助手）

2016年NgAgo技術的問世曾攪亂基因編輯的一湖池水，並掀起了驚濤駭浪而後續又飽受爭議。那麼NgAgo技術到底如何，南通大學劉東教授於2016年11月發表於Cell Res雜誌的一篇文章《NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish》似乎將籠罩於NgAgo技術的濃霧吹散了一些。

同時前幾日劉教授在基因編輯學術研討會上也以基於NgAgo技術敲低斑馬魚基因表達為題，做了細緻的研究報道。

南通大學神經再生重點實驗室劉東教授

劉東教授主要從事的血管新生方面的研究，而建立轉基因和基因敲除斑馬魚模型只是一項輔助性的基礎工作。在NgAgo技術發現之初，確實是想利用該技術進行基因敲除。但是隨著實驗的開展，他想要完成的基因敲除（knockout）並沒有實現，卻意外收穫了基因敲低（knockdown）這一結果。

基因敲除與敲低，雖然只有一字之差，但卻是兩個完全不同的學術概念。基因敲除是去掉不想要的基因，使目標基因永久性地表達沉默；而基因敲低則保留目標基因，只是阻斷目標基因的表達，但在下一代生物體內依然能夠進行基因表達。敲除是基因編輯的功能之一，而敲低則不是。

為了探索靶基因Fabp11a（脂肪酸結合蛋白11a，在調解葡萄糖和脂代謝穩態方面起著重要作用）對斑馬魚胚胎髮育中的生物功能，設計了針對該基因的兩條5 -磷酸化的ssDNA，並將其與優化過的NgAgo-2nls mRNA一起注射到1細胞期的胚胎中。

另外，為了確保注射的NgAgo mRNA能進入細胞核中表達NgAgo蛋白，研究者還專門在mRNA的兩端增加了核內定位序列（NLS），而5』-磷酸化單鏈DNA專門靶向fabp11a的第二和第三個外顯子——如果NgAgo能編輯基因，這兩段基因序列會被改變。

結果發現，注射過的胚胎中約有30%會在發育後出現兩種眼部畸形的表型：眼部有一隻相對小一點的眼睛而另一隻顯得十分小；或者兩隻眼睛融合形成一隻較大的眼睛。

儘管該表型發生了變化，但是在抽提斑馬魚胚胎（正常/突變型）DNA並對靶基因進行擴增測序後，發現靶基因沒有任何基因突變，但通過RT-PCR檢測靶基因表達卻有顯著敲低。因而，劉東團隊認為NgAgo系統確能導致斑馬魚表型改變（眼部發育缺陷），但是與靶基因的編輯無關，反是通過靶基因的敲減（knockdown）來行使功能。

此外，為了確認gDNA/NgAgo系統在斑馬魚中敲低基因是一種普遍的現象，也測試斑馬魚中的其他四個基因（ta、kdrl、lama1和flt1）。以基因ta（決定斑馬魚有無尾巴性狀）為例，研究結果發現約有30%注射過的胚胎出現沒有尾巴的表型，這也證明了NgAgo技術的knockdown作用是具有普遍性的。

無獨有偶，韓國科學家Jin-Soo Kim發表於論文預印本網站BioRxiv的文章《DNA-dependent RNA cleavage by the Natronobacterium gregoryi Argonaute》也認為NgAgo系統切割的是RNA，而不是DNA。

韓國研究者發現NgAgo蛋白具有DNA依賴的RNA酶活性（依賴於二價金屬離子），且與NgAgo結合的DNA（gODNs）序列必須與RNA反向互補，而正義DNA（sense DNA）序列則不能引導NgAgo切割靶RNA。即當與NgAgo結合的DNA序列如果與RNA序列相同，則不能引導NgAgo切割靶RNA。

他們還發現gODNs的長度和序列會對NgAgo切割RNA效率產生影響。當gODNs長度低於13個核苷酸（nt）則完全不能介導NgAgo的RNA酶活性，而鹼基錯配會影響NgAgo的酶活性，尤其是第5-14nt（5』-3』方向）的鹼基最為關鍵。因而，Kim的文章也從側面呼應了在斑馬魚體內的實驗結果。

而至於DNA序列對NgAgo系統的影響，劉東教授認為Kim的研究結果只能解釋gODNs與RNA反向互補的情況。他指出即使NgAgo介導的DNA與mRNA的序列相同，也是存在基因下調活性的，只是活性比較低。但這與Kim等人的發現並不矛盾，他推測這可能是因為DNA介導的NgAgo還會與靶基因結合，抑制了目標DNA的轉錄造成的。

因而，相比於傳統方法，NgAgo技術其敲低效率是比較高的，可作為RNAi以外的另一種基因敲低（knockdown）工具來使用。而且即便如此，關於NgAgo技術仍有一些有趣的東西沒有研究清楚，需要進一步的探索。

以上則是劉東教授關於NgAgo技術研究的後續研究工作，同樣他也希望能與其他研究團隊合作一起挖掘並推動對NgAgo和其它該家族蛋白的新的興趣點。

參考文獻：NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish

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