基因編輯技術發展現狀與趨勢：專訪復旦大學生命科學學院王永明研究員

編者按：以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術強力推動了整個生命科學研究領域的大跨步的前進。 可以預期首先在先天性遺傳性疾病、單基因疾病的治療方面，會迅速取得突破。為此，生物谷在即將召開2017 第四屆基因編輯與臨床應用研討會之際專訪了復旦大學生命科學學院王永明研究員。

生物谷: 王老師您好,非常感謝您參加生物谷主辦的2017基因編輯與臨床應用研討會, 並接受生物谷的專訪。您主要從事基因編輯技術的開發和應用研究，可以請您談一下CRISPR/Cas9的現狀嗎？距離建 立高效的CRISPR/Cas9基因編輯技術還有哪些路要走？

回答：CRISPR/Cas9技術是2013年發展起來的基因編輯技術，被認為是繼鋅指酶(ZFN)、TALEN之後的第三代基因編輯技術。CRISPR/Cas9系統包括兩個元件，分別是Cas9內切酶和guide RNA(gRNA),gRNA引導Cas9蛋白在靶位點進行切割，形成 DNA雙鏈斷裂(DSB)。細胞的修復系統修復雙鏈斷裂的DNA時，會定點產生突變，這就是基因編輯。如果想改變不同的位點，只需要表達相應的gRNA就行了。細胞修復DNA主要依靠兩種途徑，分別是非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HR）。非同源末端連接是高效的修復途徑，修復系統對DNA末端做簡單的修飾後重新連接在一起。這個過程經常會產生鹼基的插入或缺失（indel），如果indel發生在編碼區，就有可能造成移碼突變，使基因失去功能，這種方法用於敲除基因。研究人員通常將表達Cas9和gRNA的質粒轉染到感興趣的細胞中來製作基因敲除的細胞模型。在轉染效率高的細胞系如HEK293中，編輯效率一般在10-30%左右。有的細胞轉染效率低，編輯效率也低，如在人的胚胎幹細胞中編輯效率為1-25%。這時可以通過流式細胞分選儀將轉染成功的細胞分選出來提高效率。我們最近利用附著體載體表達Cas9和gRNA，同時表達嘌呤黴素抗性基因，既可以長期編輯細胞，又可以富集轉染成功的細胞，這是目前最高效的基因編輯技術，這種方法只適合於基因的敲除，在胚胎幹細胞中效率最高可達到100%。

同源重組途徑需要提供一個同源模板供體，可以是質粒或者單鏈DNA。DNA雙鏈斷裂處把供體遺傳信息拷貝過來修復基因，這種方法的優點是可以精確的改變DNA序列，缺點是效率低。如何提高同源重組是基因編輯領域的一個重大挑戰。利用質粒當作供體，同時加上一個篩選基因，這種方法的效率還是非常高的，但是製作供體工作量大，編輯後還要去除篩選基因，整個實驗周期長。這種方法顯然無法用於基因治療，因為質粒供體無法導入體內細胞中。短的單鏈DNA oligo也可以做供體，合成DNA oligo成本低，速度快，同源重組後不存在去除篩選基因的步驟。但是這種方法重組效率很低，除了幾種容易轉染的細胞，在大多數細胞中難以檢測到編輯成功的細胞。有幾篇文章報道他們通過加小分子化合物或者優化oligo的設計方案得到了很好的編輯效率，但是我們的實驗結果表明效率依然不理想。同源重組效率和編輯位點所處的基因組位置有很大的關係，有的位點容易發生同源重組，有的不容易。調控DNA修復途徑可能會提高同源重組，但是目前提高的效果有限，調控DNA修復途徑還會增加基因組突變的風險。所以如何提高同源重組還有很長的路要走。

生物谷: 去年韓春雨的NgAgo基因編輯技術鬧得沸沸揚揚， 恰好您和南通大學神經再生重點實驗室副教授劉東領導的團隊一起發表了一篇題為《基於NgAgo的fabp11a基因敲低引起的斑馬魚眼睛發育缺陷》的文章， 當時文章里揭示了NgAgo有降低基因表達的現象， 對機理方面未作深入闡述， 請問後來您還在做這方面的機制研究嗎？ 您對DNA引導的基因編輯技術有何看法？

回答：CRISPR/Cas9技術編輯的位點需要有GG序列，而NgAgo沒有任何序列的限制，所以韓教授的發明引起了巨大的轟動。當時上海東方財經電視台還就這個熱門事件採訪了我。基因編輯技術的原創性工作都是在國外做的，韓教授這個發現改變了這種格局。我們在斑馬魚中測試了NgAgo的編輯效果，觀測到了魚的眼睛發生了表型改變，但是沒有檢測到基因編輯，也就是說DNA序列沒有發生改變。但是，我們意外的發現 NgAgo可以降低基因表達,當時陸續有很多實驗室聲明利用NgAgo無法實現基因編輯，為了儘快分享我們的結果，沒有做深入的機制研究就把文章發表了。後來韓國的一個課題組發現NgAgo可以利用單鏈DNA在體外識別並切斷RNA，這部分解釋了NgAgo降低基因表達的機制。我們在斑馬魚中的結果表明單鏈DNA不需要識別RNA也能降低基因表達，這就說明還存在其它降低基因表達的機制。我們正在探索新的機制，並取得了一定的進展，希望能儘快與大家分享。

DNA引導的基因編輯在理論上是可行的，在溫度較高的情況下，某些Ago蛋白可以實現基因編輯。現在的問題是如何找到37度能實現基因編輯的Ago蛋白，或者如何讓高溫下工作的Ago蛋白在37度下工作。我們期待這一天早日到來，同時也期待韓教授在基因編輯方面取得突破。

生物谷: 我們了解到您和您的團隊在研究運用基因組編輯技術把基因突變引入到人體多能幹細胞中製作心臟病模型，通過這些模型研究先天性心臟病的發病機理和篩選治療藥物，這項研究進展如何可以跟大家分享一下嗎？運用到臨床上是提供一個可能伴有併發症的臨時解決方案？還是都能做到真正修復損傷？

回答：幹細胞領域是近些年發展非常快的一個領域，尤其是2006年日本科學家山中伸彌建立誘導幹細胞技術以來。多能幹細胞包括胚胎幹細胞和誘導幹細胞，它有兩個特點，一個是在體外能夠連續培養依然保持多能性，另外一個是它可以分化為人體組織的各種細胞，這就為疾病研究和治療打開了大門。從患有遺傳疾病的患者身上獲取皮膚細胞，誘導成幹細胞，再分化成組織特異的細胞，就可以在細胞水平上研究疾病的發病機理，篩選治療藥物。除了這種方法，還可以通過基因編輯技術在正常的細胞中引入突變製作模型，這種方法更簡單快捷，不需要尋找病人，正常的細胞還可以作為很好的實驗對照。我在第一代基因編輯技術鋅指酶技術剛商業化的時候就開始應用該技術製作心肌病模型，包括長QT綜合征和肥厚型心肌病模型，這些模型可以用於機理研究和治療藥物的篩選。回國後由於精力有限，暫時沒有繼續這方面的研究，後面會繼續開展這方面的工作。

利用基因編輯技術治療疾病是目前的一個研究熱點。主要有兩種治療策略，一個是將病人的細胞分離出來培養，利用基因編輯技術修飾細胞，再將細胞輸回體內治療。比如HIV病毒通過CCR5受體攻擊T細胞。如果利用基因編輯技術將T細胞中CCR5基因敲除，HIV病毒就無法攻擊T細胞，艾滋病就會得到治療。但是用這種方法治療除血液病之外的其它疾病非常困難，主要是細胞移植後難以存活。另外一種策略是直接將CRISPR/Cas9導入體內編輯致病基因。例如DMD基因突變會導致杜氏肌營養不良症，大多數突變發生在45-55號外顯子上，導致蛋白表達在此處終止。如果利用基因編輯技術把45-55號外顯子切除，後面的蛋白就可以表達，整個蛋白雖然中間少了一段，但是仍然可以發揮功能，小鼠實驗表明肌肉功能得到改善。

心臟疾病通過細胞移植治療是非常困難的，一個原因是移植細胞難以存活，另外一個原因是移植的細胞與原有的心肌細胞跳動不同步，引發心律失常，危及生命。有些心臟病的發生是由於顯性負效應突變導致的。我們知道一個細胞中基因有兩個拷貝，顯性負效應突變使自己功能喪失的同時，還會降低正常基因的功能，如果利用基因編輯技術將顯性負效應突變改為功能缺失突變，正常拷貝的功能不再受到干擾，也許會取得治療效果。我們在做這方面的治療研究。這種做法的一個風險是細胞中只剩下一個拷貝的基因，有可能表達劑量不足，無法治癒疾病。另外，在編輯突變的拷貝時，很容易將正常的拷貝也編輯了，這也是要克服的難題。這方面的治療策略都是減輕病症，而並不是完全的修復。要想完全的修復損傷需要通過同源重組修復基因突變，這在體內是非常難實現的。最近有一種新的基因編輯技術，可以把一個鹼基轉變為另一個鹼基，這為體內修復基因帶來了曙光。這種技術存在效率低、脫靶率高等問題，在用於治療前需要克服。

生物谷: 目前基因編輯已經應用到多個領域，吸引了很多的優秀人才開始嘗試將基因編輯技術應用於人類各個行業的發展。針對CRISPR的局限，剪切導致的脫靶以及只能利用病毒載體運送DNA，現在有什麼可行的解決方法么？

回答：脫靶剪切是大家都關注的一個問題，脫靶剪切的原因是基因組中有很多和靶向序列非常相似的序列，這些序列容易被識別切割從而產生突變，如果這些序列有功能的話，會引發疾病。科學家已經發明了一些降低脫靶的技術，一個是double-nicking技術，就是在Cas9上引入一個點突變，使得Cas9隻能切斷DNA雙鏈中的一個鏈，同時表達兩個gRNA，在DNA雙鏈上分別產生一次切割，形成雙鏈斷裂，這就降低了脫靶。還有一種方法是在Cas9上引入幾個突變，降低Cas9蛋白和DNA的非特異性結合，也可以有效的提高脫靶切割。這些技術在降低脫靶的同時，也降低了編輯效率。實際上，如果設計的gRNA序列在基因組中非常特異的話，脫靶效率是非常低的。包括我們在內的數個實驗室通過實驗均表明在幹細胞中很難檢測到脫靶。之前的幾個課題組在研究脫靶時，選用的gRNA在基因組中都有非常相似的序列，這就造成了脫靶效率高的現象。在做基因治療時，突變拷貝和正常拷貝往往只有一個鹼基的差異，這時候確實存在很高的脫靶，需要謹慎編輯。在體內進行基因編輯治療時，目前最有效的方法是利用病毒載體將CRISPR/Cas9系統導入細胞內。AAV病毒能夠組織特異性的感染細胞，免疫排斥反應小，最具有治療前景。一部分科學家在發明用化學試劑轉染體內細胞，這種方法除了要克服轉染效率低的問題，還要克服對細胞毒性大的問題。

王永明研究員

復旦大學生命科學學院

個人簡介：研究員，博士生導師，2015年國家青年千人獲得者。1997-2001年就讀蘭州大學生命科學學院並獲得學士學位，2001-2004年就讀東北師範大學生命科學學院並獲得碩士學位，2005-2010年在德國馬克斯-德爾布呂克分子醫學中心（MDC）做博士生研究，並獲得柏林自由大學博士學位。2010-2013年在斯坦福大學醫學院從事博士後研究。2013年至今歷任復旦大學生命科學學院青年研究員、研究員。主要從事基因編輯技術的開發和應用研究，先後在Circulation Research,Journal of the American College of Cardiology, Nucleic Acids Research和PlOS Genetics等雜誌發表重要文章。

王永明研究員將出席2017（第四屆）基因編輯與臨床應用研討會，並帶來「利用附著體技術在人體多能幹細胞中實現高效的基因編輯」的主題報告。

大會日程

會議諮詢：

王聯宇

E-mail:lianyu.wang@bioon.com

Mt:17301620727

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