RNA化學修飾成為研究焦點

在蛋白質合成過程中，細菌核糖體與信使RNA結合，圖為該複合體的分子模型

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隨著科學家對RNA化學修飾研究的深入，表觀轉錄組學的研究工具進一步增加。

2004年，以色列特拉維夫大學的腫瘤學家吉迪恩?雷肖比（Gideon Rechavi）和同事們比較了所有人類基因組DNA序列和對應的信使RNA序列，信使RNA（mRNA）攜帶著基因製造蛋白質的所需信息。他們正在尋找一種改變，組成RNA序列的一種核苷酸組件——腺嘌呤核苷（簡稱A）被換成了另一種標準組件——次黃嘌呤核苷（簡稱I）。這種「A到I的變化」會改變蛋白質的編碼序列，在人類發展史中，對於維持先天免疫應答至關重要。「我們的工作聽起來很簡單，實際上非常複雜，」雷肖比回憶到，「已經有不少研究小組嘗試過，但都失敗了。」究其原因，主要是測序錯誤和單核苷酸突變使數據受到干擾。但是，利用新的生物信息學方法，雷肖比的團隊在轉錄組（生物體或細胞群體中所有的mRNA）中發現了上千個變化了的修飾位點，隨後又增加到了數百萬個。

次黃嘌呤核苷多少有點特殊：通過比較DNA和RNA序列，研究人員能夠輕易地發現這種缺陷。不過，至少有1/4的mRNA帶著化學標記，也就是組成RNA的A、C、G、U四種核苷酸被修飾過，但是目前的測序技術是無法發現的。（類似的標記在DNA上也有，稱為表觀遺傳學標記。）現在，科學家尚不清楚RNA上的化學修飾有何用途，還需要努力研究。

在過去5年中，科學界掀起了研究N6-甲基腺苷（m6A）的浪潮：在轉錄組中確定m6A的位點圖譜，並證明這一修飾對健康和疾病至關重要。不過，研究工作量巨大：在mRNA和其他RNA的轉錄產物上都有這一標記，而且幾乎所有物種內都有，甚至病毒也不例外。

核苷酸上的化學修飾本身並不是惹人注目的新發現。讓它走上前台並讓表觀轉錄組學成為焦點的是一類酶的發現，這些酶各自負責化學修飾的添加、去除或者是與化學修飾結合，發揮特殊作用。2010年，芝加哥大學的化學生物學家何川提出，化學標記是可逆的，對基因表達起著重要調節作用。不多久，他的研究團隊就找到了第一個「橡皮擦」，這種名為FTO的酶能夠去除mRNA上的甲基標記。也就是說，細胞能夠主動地控制m6A。這個發現利用了新一代測序技術，能繪製出m6A和轉錄組中其他化學修飾的位點圖譜。

如今，表觀轉錄組學正在蓬勃發展，不過相關的工具卻還不完善。當前的方法缺乏靈敏度，不能用於檢測珍稀樣品。科學家既不能確定轉錄組中特定化學修飾的數量，也不能在單次實驗中繪製一種以上的化學修飾位點圖譜。芝加哥大學的分子生物學家潘濤與何川合作研究FTO，他表示：「目前我們亟需新技術來檢測各種RNA化學修飾。」

甲基化RNA二聚體

這就是說，表觀轉錄組學的研究人員正在為他們的領域有了方向而歡欣鼓舞。美國威爾康奈爾醫學院的遺傳學家克里斯?梅森（Chris Mason）領導了繪製m6A位點圖譜的工作，他說：「正如你想到DNA就會想到DNA的組裝和表觀遺傳學修飾一樣，我認為，在現在和未來，在提到RNA時，沒有人會不想到『如何修飾』這個問題。」

利用抗體繪製修飾位點圖譜

早在20世紀70年代，科學家就利用m6A上的放射性同位素標記第一次證明了mRNA存在化學修飾。但是，這個研究原理是，mRNA轉錄物的3′末端含有一串腺嘌呤核苷，以此選擇性富集mRNA轉錄物，研究人員擔心，這些標本可能含有痕量的其他類別的RNA分子。威爾康奈爾醫學院的化學生物學家薩米?賈弗里（Samie Jaffrey）說：「人們停止了這方面的研究，因為太難判斷，mRNA中的m6A到底是不是污染物。」

同樣困難的是弄清轉錄組中m6A位於何處，這有助於理解m6A的功能。常規的測序方法需要逆轉錄——把RNA轉換成互補DNA（cDNA）——然後擴增、測序。問題在於製備cDNA的逆轉錄酶經常會把化學修飾除去。賈弗里指出：「那樣就不可能看見m6A了，逆轉錄以後，它就像個普通的A一樣了。」

雖然存在技術難題，但是科學家意外地發現了一種細菌RNA的化學修飾，這引起了賈弗里的興趣，他準備在哺乳動物的RNA中尋找這種修飾。他與梅森合作，研究小組把RNA切割成小段，用抗體分離出包含有m6A的部分，然後進行測序。「我們清楚地看見mRNA的標籤，非常顯眼。那絕不是污染。」賈弗里說。雷肖比的團隊也進行了類似研究，發現了大量的m6A，在7 000個人類基因上有12 000個位點。該團隊還發現，這種修飾常常集中出現在外顯子和終止密碼子中，前者是蛋白質編碼區，後者是mRNA中代表蛋白質編碼序列結束的3個密碼子。

上述研究人員採用的方法是m6A-seq和MeRIP-seq，已經廣泛應用於繪製不同疾病背景和生物體中的m6A位點圖譜。針對m6A的抗體和試劑都可以在網上獲取。研究人員認為，這種化學修飾控制著細胞發育成不同類型的過程，這個過程一旦異常就會導致癌症。實際上，表觀轉錄組與癌症的第一個聯繫已經被發現。何川的團隊證實，在某些急性髓細胞白血病病例中，存在遠高於正常水平的FTO酶，將刺激細胞分化的轉錄產物上的m6A除去。

與此同時，另一個研究小組對何川團隊的成果進行了不同的解釋。使用分辨度更高的新一代抗體做圖法（miCLIP），賈弗里的團隊證實m6A的抗體也能與N6, 2′-O-二甲基腺苷（m6Am）結合，這是對mRNA 5′末端化學結構的修飾。當時，賈弗里並不知道m6Am究竟有什麼生物學意義。但是，他的團隊發現m6Am（不是m6A）是FTO清除作用的主要目標，它會影響mRNA的穩定性和亞細胞定位。對於賈弗里來說，何川團隊之前的研究成果將FTO與急性髓細胞白血病關聯起來，正說明m6Am（不是m6A）與癌症的起源和發展有不可忽視的關係。

癌症生物學家霍華德?張

斯坦福大學的癌症生物學家霍華德?張（Howard Chang）指出，這種差異在新興領域是常有的事。「這一特殊問題與早期研究組蛋白化學修飾時遇到的問題並沒有什麼不同。」他舉例說明，DNA被緊緊包裹在細胞中，而經過化學修飾的組蛋白在DNA周圍。

更多化學修飾

RNA上的其他化學修飾同樣吸引著科學家們的注意。2016年，北京大學的化學家伊成器的研究團隊和雷肖比、何川的團隊都利用抗體在小鼠和人類細胞系中找到了N1-甲基腺苷（m1A）。兩個研究小組用不同的方法保護m1A不被逆轉錄干擾，他們的研究都證實，早在20世紀60年代就在總RNA中發現的m1A位於mRNA開始生產蛋白質的位點上。壓力條件改變可化學修飾的位點，說明它們是動態的。

關於m1A的作用，目前科學家們還不得而知，不過他們有一個令人嚮往的線索：大多數轉錄產物只有一個m1A位點，這樣的產物翻譯成蛋白質的概率比那些缺乏修飾的更頻繁。「這是令人興奮的現象，當然也是複雜的，我們正在研究一種新的mRNA翻譯調節機制。」雷肖比說。

其他整體位點圖譜方法依賴於這樣的事實，有些RNA化學修飾充當了附加化學標記的手柄。2011年末，伊成器組建了實驗室，當時假尿苷（pseudouridines或pseudoU）在許多種類的RNA中都發現了，唯獨mRNA中沒有。2015年，他的團隊描述了一種化學標籤和拉下（pulldown）方法用於富集轉錄產物上的修飾。出乎他的意料，pseudoUs在小鼠和人類的mRNA中含量比預想的要豐富得多。於是他的工作重點就轉移到研究這個標記的功能。「我認為，pseudoU在mRNA中有多重作用，這取決於何時、何地、如何安裝和調控RNA的轉錄。」伊成器說。他補充說，我目前已經知道，這些pseudoU是化學標記的「寫入者」，是否也是「閱讀者」和「清除者」呢？仍然懸而未決。

圖譜技術的進展

無論是用抗體還是化學方法，繪製RNA化學修飾位點圖譜都是一項棘手的任務。梅森指出，抗體會與其他化學修飾交叉反應，所有研究人員要用至少兩種不同抗體對結果做互相關（cross-correlate）分析。與其他方法相比，化學方法能切斷、結合或者富集某些區域，對其他區域的檢測效果卻不盡人意。伊成器說，測序深度和生物信息學演算法選擇也會影響修飾位點的檢測。甚至，細胞在培養中保持活性的時間長短都會影響修飾水平，梅森說，所以，找到圖譜基線對於對照至關重要。

但是無論如何，僅僅顯示樣品中含有特定的化學修飾還不夠。相反，對所有的RNA化學修飾進行定量是至關緊要的，因為細胞可能就是依賴某個化學修飾的正確數量來發揮正常功能，潘濤說道。有些研究者想通過增強寫入和擦除酶來調整修飾水平，因此定量對他們來說尤其重要。僅僅存在這樣的酶就可以表明，精確調整修飾水平是重要的。

2015年，潘濤的團隊描述了一種量化化學修飾的有效方法，至少在一種名為「轉移RNAs」的RNA上是有效的。具體方法是：用逆轉錄酶讀取各種化學修飾，從而獲取第一個化學修飾下游的序列。目前，潘濤表示，他的小組正在把同樣的技術運用到如m1A等mRNA化學修飾上。

不過，也許確定功能最快的方法是識別這些標籤的「閱讀者」、「寫入者」和「清除者」。2012年，雷肖比團隊進行了m6A-位點圖譜研究，創造了大量帶有或不帶有m6A化學修飾的RNA短片段，以它們為誘餌釣出了與RNA結合的蛋白質。2014年，他的團隊採用類似的策略發現了一些m6A的「閱讀者」。其他研究也推斷出與此不同的細胞功能。現在，雷肖比打算用同樣的誘餌法把m1A的「閱讀者」也釣出來，雖然這可能會更困難，因為m1A集中的位點（就是蛋白質的翻譯起始點）結構比m6A的序列更複雜。

一旦確定某個酶是某個化學修飾的「閱讀者」，基因編輯技術就可以輕易調節蛋白的表達，讓研究人員從細胞的總體改變中探明化學修飾作用。例如，霍華德的一項研究除掉了m6A的一個「閱讀者」酶，以此證明了這種化學修飾在決定細胞命運時的重要性。

但是如同所有的後天獲得的性狀一樣，解釋這些發現非常複雜，比如同樣的酶可能與大量不同的RNA作用，一種化學修飾也可能在不同的RNA中有不同的作用，霍華德指出：「如果通過研究其他物種的RNA而取得突破，而不是人的RNA，我一點也不會驚訝。化學修飾在細胞中大量存在且十分重要。」

更多研究工具

近年來，何川的團隊發現，RNA化學修飾提供了一種調控轉錄產物的方法，在不少細胞功能中發揮作用，比如開啟細胞分化的過程。研究人員需要更好的技術來探究它們之間的聯繫，於是，2016年10月，美國國立衛生研究院（NIH）決定，給予何川和潘濤5年時間、投入1 060萬美元，建立一個技術開發中心，為識別和繪製RNA化學修飾位點圖譜服務。何川表示，最大的關注點是想出能在修飾位點上產生突變並能擴增的方法。

藉助新的成像技術，今後科學家可能對特定轉錄產物上的某個化學修飾做圖像分析。「我多麼渴望有人能發明一種技術，讓我看到mRNA上的m6A修飾。」何川說，不過，現在還是不可能的。傅燕是他以前的研究生，目前正在哈佛大學生物物理學家庄小威的實驗室中工作。傅燕把超解析度顯微鏡與庄小威開創的單細胞RNA MERFISH成像結合。傅燕說，自己在過去兩年中取得了進展，但是數據有干擾，需要進一步優化條件，以便更有效地檢測出化學修飾。

電子顯微照片，RNA聚合酶分子與DNA鏈的特異連接物

另一些研究人員正在設法避開傳統RNA測序中的問題。英國牛津納米孔公司(Oxford Nanopore Technologies)報告，他們延伸了RNA與線性DNA，讓其通過鑲嵌在膜中的納米孔。美國太平洋生物技術公司也宣布，運用該公司的單分子實時（SMRT）化學測序技術，他們能直接對RNA測序。「這個想法在SMRT研製時就有了。」公司的首席科技官喬納斯?庫爾賴斯（Jonas Korlach）說。SMRT利用複製DNA鏈的DNA聚合酶，能夠實時觀察到熒光核苷酸聚合成DNA鏈。為了讓這些技術能用於RNA，庫爾賴斯、梅森和合作者用HIV中的逆轉錄酶取代了聚合酶。與DNA平台一樣，修飾過鹼基與未修飾鹼基在聚合速率上截然不同，前者遠低於後者，從而讓每種修飾都具有了「動力學特徵」。

不過，技術上的障礙仍然存在，RNA結構本身比DNA更複雜。一是RNA容易自身摺疊形成環和結等高級結構。在他們的研究中，牛津納米孔公司把RNA組裝到cDNA上，能「燙平」二級結構，讓RNA穿過小孔。二是RNA比DNA容易降解，妨礙長時間的測序過程。

還有另一個挑戰存在於數據方面，那就是RNA化學修飾的數量。在同一個RNA分子中識別出多種不同的化學修飾需要大量的訓練集才能教會探測軟體辨別不同的化學修飾。溫斯頓?提姆普（Winston Timp）是約翰?霍普金斯大學的生物醫學工程師，他已經利用牛津納米孔公司的技術開發了新方法用於探測特殊的DNA修飾。他打算把這一技術應用到RNA上，開發識別m6A修飾的訓練集。「問題是，我們不知道一個特定的分子上的化學修飾到底會有多麼不同，但是那正是我們要研究的，這是令人興奮的研究領域！」他說。

作者：卡瑞馳（Kally Rae Chi）是《自然》雜誌記者。

張文韜/編譯 世界科學（World-Science）