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國內長非編碼RNA又一篇cell!9張圖帶你看完sno-lncRNA的研究歷程

國內長非編碼RNA又一篇cell!9張圖帶你看完sno-lncRNA的研究歷程


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5月4日,上海生化所的陳玲玲研究員在cell上發表題為《SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription》的文章,該研究揭示了長非編碼RNA SLERT通過鬆弛DDX21的環形結構,從而促進Pol I轉錄 rRNA的重要作用。

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值得注意的是,SLERT是一個sno-lncRNA。Sno-lncRNA是一類新型的長非編碼RNA,它們的序列中包含完整的snoRNA序列,並且該序列對sno-lncRNA的穩定性和亞細胞定位至關重要。sno-lncRNA在2012年由陳玲玲課題組率先鑒定出來,至今,已有3篇有關sno-lncRNA功能的文章在頂級期刊上發表,均出自該課題組。

隨著二代測序技術和生物信息學的發展,RNA測序的門檻漸低,越來越多的實驗室可以獨立開展RNA測序的分析和研究,那麼,是什麼原因使得陳玲玲研究員課題組脫穎而出,發現了這樣一類特殊的長非編碼RNA呢?下面,小編將用9幅圖帶大家回顧sno-lncRNA的發現和研究歷程。

2011年,陳玲玲研究員在Genome Biology上發表題為《Genomewide characterization of non-polyadenylated RNAs》的文章,該文雖未提及sno-lncRNA,但卻是這類全新的長非編碼RNA研究的開端。我們知道,mRNA的3』poly(A)對其穩定性非常重要,大部分長非編碼RNA也有3』poly(A),但細胞中存在一類沒有ploy(A)的RNA,為了研究這類RNA如何維持自身的穩定性,他們首先對此類RNA進行了系統的鑒定。

圖1.1,是RNA-seq的建庫方法,通過3次oligo(dT)的洗脫,剩下的RNA經2次去rRNA處理,最終得到的RNA被認為是non-poly(A) RNA(也稱為poly(A)-RNA)。將poly(A)-RNA和poly(A)+RNA進行測序分析,研究人員首次得到了最全的poly(A)-RNA和poly(A)+RNA測序數據。並對含有不同長度的poly(A)的RNA的比例及poly(A)-RNA的來源做了分析(圖1.2和圖1.3)。

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2012年,陳玲玲組通過分析poly(A)-RNA的數據在Molecular Cell發表首篇有關sno-lncRNA 的文章《Long Noncoding RNAs wuth snoRNA Ends》。該研究首次鑒定了5個sno-lncRNA,分別命名為sno-lncRNA1, sno-lncRNA2, sno-lncRNA3, sno-lncRNA4和sno-lncRNA5,他們均是包含2個snoRNA,並且位於3』和5』端(圖2.1)。通過進一步的研究,發現兩端的snoRNA對sno-lncRNA的穩定性至關重要(圖2.2),並且5個sno-lncRNA均定位在細胞核,與產生它們的母基因完美重合(圖2.3)。

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這裡需要補充的是,產生sno-lncRNA的基因位點與普瑞德威利氏症候群緊密相關。該疾病由產生sno-lncRNA的基因位點(該基因位點包括SNORD116及IPW等基因)的缺失引發,導致患者肥胖及智力低下。sno-lncRNA在患者的基因組中的缺失,是否是疾病發生的原因呢?為了探究sno-lncRNA的功能,研究者使用RNAi的技術敲低了這5個sno-lncRNA,發現與神經發育等相關的基因發生了可變剪切(圖3.1)。通過分析CLIP-seq數據,發現5個sno-lncRNA均與剪切因子FOX2結合,並影響FOX2的功能(圖3.2)。最後提出sno-lncRNA通過與FOX2作用,保證發育正常進行的假說(圖3.2)。

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2014年,陳玲玲課題組在BMC Genomics發表題為《Species-specific alternative splicing leads to unique expression of sno-lncRNAs》的文章,系統鑒定了不同物種間的sno-lncRNA,並發現sno-lncRNA具有很強的物種特異性(圖4)。

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2016年,陳玲玲組在Molecular Cell上發表文章《Unusual Processing Generates SPA LncRNAs that Sequester Multiple RNA Binding Proteins》。有趣的是,這篇文章的主角——SPA,是一個5』端由snoRNA構成,3』端卻有poly(A)的sno-lncRNA(圖5.1),而之前鑒定的sno-lncRNA都是兩端都由snoRNA構成。這樣特別的sno-lncRNA是如何產生的呢?通過一系列實驗,研究人員認為SPA的產生需要snoRNA,弱poly(A)信號以及快速的RNA聚合酶II(圖5.2)。

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那麼,SPA又有什麼樣的功能呢?我們注意到,在2012年的那篇文章中,缺少敲低sno-lncRNA後的細胞表型實驗的結果,而SPA的產生位點與sno-lncRNA1-5相近,SPA的缺失與普瑞德威利氏症候群有關嗎?研究者利用CRISPR技術,對SPA進行了基因位點的敲除,但是並沒有觀察到該基因的缺失對細胞的增殖和凋亡有影響。對此,研究者給出的解釋是由於普瑞德威利氏症候群並不是致死的疾病,所以SPA的敲除應該與發育相關,而不是細胞的增殖。但由於正如小編之前提到的,sno-lncRNA在物種間並不保守,小鼠中沒有相應的SPA,所以也很難從動物模型的角度證明SPA的功能。

關於SPA在細胞中扮演的角色,研究者通過SIM和RNA pulldown技術發現,SPA可與TD43,RBFOX2及hnRNP結合(圖6.1)影響基因的可變剪接(圖6.2)。至此,本研究鑒定了新的lncRNA,即5』是snoRNA,3』是poly(A)的SPA。並形成了該類lncRNA的產生需要快速轉錄的RNA聚合酶II,上游弱poly(A)信號以及snoRNAd 保護及通過結合RNA結合蛋白影響RNA可變剪接發揮作用的假說(圖6.3)。

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時間回到現在,又回到了我們在文章開篇提到的文章《SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription》。與前兩篇文章鑒定sno-lncRNA不同,SLERT的基因位置並不是15號染色體上缺失會導致普瑞德威利氏症候群的區域。SLERT來自7號染色體,母基因為TBRG4(圖7.1),由TBRG4 mRNA的可變剪接形成。與sno-lncRNA1-5類似,SLERT的兩端由snoRNA構成,並負責維持其穩定性(圖7.2)。巧合的是,SLERT也在細胞核中,精確定位在核仁中,snoRNA序列對其亞細胞定位有決定性作用(圖7.3)。

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由於核仁與rRNA的合成息息相關,而rRNA的異常表達與疾病緊密相連,所以研究者們很快將研究重點放到了SLERT是否影響rRNA合成及如何影響。利用CRISP技術敲除SLERT後,非常幸運,研究者發現rRNA發生了變化(圖9.1)。通過RNA pull down技術找到與SLERT結合的DDX21蛋白。DDX21可以形成環狀結構,並將Pol l包裹其中,阻礙Pol l對rRNA基因的轉錄。利用SIM技術,研究人員拍了一張非常驚艷的圖。從圖8.3,我們可以清楚的看到SLERT與DDX21及RPA194形成複合體。那麼SLERT與DDX21的結合是如何影響Pol l的轉錄的呢?研究人員通過細緻的研究,發現SLERT可以改變DDX21的構象——環的大小,從而影響DDX21對Pol l的抑制作用(圖8.4)。

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文章到此,已經清楚的證明SLERT如何影響rRNA的合成,那麼接下來的問題是,SLERT在細胞中,特別是腫瘤細胞中扮演了什麼樣的角色。(想起之前的sno-lncRNA均沒有表型圖,那麼SLERT是否讓人眼前一亮呢?)研究人員檢測了敲除SLERT後細胞的表型,發現細胞增殖明顯降低,小鼠成瘤實驗也證實了這一點(圖9)。至此,陳玲玲老師給我們展現了SLERT的一個非常完整的研究。

圖9.假說及表型

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9幅圖講完了,相信大家對sno-lncRNA的研究也有了認識,細胞中其他的sno-lncRNA又扮演了怎樣的角色,又將向我們講述怎樣的故事呢?期待更多的研究!

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