力學細胞學：論細胞如何通過擠來擠去影響彼此的生命歷程

原文以Mechanobiology: A measure of molecular muscle為標題

發布在2017年4月12日的《自然》科技專題上

原文作者：Michael Eisenstein

創新工具幫助揭示引導胚胎髮育和腫瘤生長等細胞過程的力。

在顯微鏡下，細胞往往呈靜態 — 具有生物結構的固體元素。然而在現實中，它們是動態的結構，在擁擠的環境中擠來擠去以獲得空間。細胞擠壓、拉伸、彎曲和牽拉它們周圍的東西以及彼此，這樣做的時候會產生力的作用。這些力極小 — 在皮牛頓的級別，或者說略相當於一個曲別針重量的十億分之一，但仍能產生重大的生物學影響。在快速生長的胚胎中，不斷變化的作用力能夠改變細胞的發育過程，告訴它們什麼時候停止分裂並開始轉變為大腦或骨骼。

細胞中的蛋白質結構承受併產生微小的力，科學家正在學習如何在微觀尺度上對其進行描繪。

Carsten Grashoff

一個世紀前，蘇格蘭科學家D Arcy Thompson提出物理上的力會影響細胞功能的觀點。他在他的開創性著作《生長和形態》中寫道：「細胞與組織，殼與骨，葉與花，是物質的不同表現形式，其粒子的移動、塑造和成型遵守物理學定律。」

Thompson基本為理論性的工作為大量的生物力學原理實驗研究鋪平了道路。德國慕尼黑馬克斯普朗克生物化學研究所研究細胞力的Carsten Grashoff表示：「生物力學是一個非常古老的領域 — 只是人們長期忽視了它。」從某種程度上來說，這是由於研究人員缺乏能夠精確測量分子級別力的技術。

現在，科學家們已經有了工具，能夠在顯微鏡下描繪皮膚細胞在傷口癒合時向前爬的力，或者對細胞編碼使之能夠在蛋白伸展和放鬆時閃爍。但困難仍然存在 — 研究人員很難從隨機的生物雜訊中分辨出細胞力的真實影響，而且還沒有徹底搞清楚這些過程如何在活的有機體這種複雜環境中發揮作用。但是，通過將「力學生物學」工具與其他遺傳學的和生化活動的測量手段結合起來，研究人員開始可以了解力如何被轉化為功能。

加州斯坦福大學的機械工程師Beth Pruitt說：「生命過程不僅僅是生化信號通路。當你拉一個蛋白質，你可能打開或關閉了一個結合位點，從而按下了開關，選擇了哪一個程序將被細胞運行。」

獲得牽引力

細胞主要通過嵌在細胞膜上的蛋白質與環境相互作用，這代表了產生和解釋細胞力的關鍵點。一些蛋白質會響應液體流動對其產生的「推力」，就像在血管中的情況；而另一些蛋白質在細胞被其鄰近細胞拖拽或黏附到其他鄰近蛋白質時，產生與張力相關的信號。

20世紀90年代，牽引力顯微鏡（TFM）出現，成為第一個真正可以定量測量這種力的工具。 例如，1999年，當時供職於伍斯特麻省大學醫學院的Yu-Li Wang和附近波士頓大學的Micah Dembo，將一種稱為成纖維細胞的結締組織細胞鋪在一種嵌入了熒光微珠的凝膠材料上。隨後他們展示了可以使用TFM，通過測量微珠的位移來推算出這些細胞產生的力。德國埃爾朗根-紐倫堡大學的生物物理學家Ben Fabry說：「這就像一個彈簧秤，你對彈簧秤施重並測量其變形程度，如果你知道彈簧的剛度，你就能確定力的大小。」

TFM已經成為研究單個細胞和組織樣互連細胞片層的標準方法。Clare Waterman任職於馬里蘭州貝塞斯達的國家心臟肺血液研究所，她已經使用TFM來研究細胞遷移，該過程在一定程度上由被稱為黏著斑的細胞結構將自身粘連在周圍細胞外基質（ECM）上時所產生的力介導。

Waterman小組開發出了相關方法來增加TFM實驗可以成像的微珠數量，以便產生超高解析度的力圖。她說：「我們可以在每個黏著斑下設置50個標記物，所以我們可以達到亞微米級別的解析度。」這使得她的小組能夠揭示在黏著斑處產生的力，是如何觸發在胚胎髮育等過程中協調定向細胞運動的分子事件。

當然，微珠對細胞運動的響應是一個多維移動，這種多維移動比一維的彈簧秤變形要複雜得多。TFM最初需要強大的超級計算機來解讀數據，不過現代計算方法已經使該技術更易使用。即使如此，將微珠的位移數據轉換成力的測量仍然具有挑戰性，並且存在很多潛在的錯誤源。Waterman說：「可能有一個單細胞在相反的方向拉，使它看起來基本上沒有形變。而且當微珠的運動超出了細胞的邊界，就將很難處理。」

其他研究團隊正在將TFM擴展到三維，以更好地映射生物學上的實際情況。例如，Fabry和他的同事開發了一種TFM方法，使用膠原蛋白構成的凝膠，在三維跟蹤細胞力，膠原蛋白是ECM的一種關鍵的蛋白質成分。他的團隊能夠探測乳腺癌細胞的形狀、細胞產生的力、以及細胞通過一種合成的三維『組織』時的速度和方向這幾者之間的關係——有望為癌細胞的轉移生長建模。

但他的方法也加大了對分析和計算的挑戰。Fabry說：「膠原蛋白是非常難處理的材料 — 它的行為是高度非線性的，也就是說，如果你稍微拉伸它一點，它是柔軟的，但如果你多拉伸一點，它會突然變得非常僵硬。」

為了避開這個計算上的負擔，新澤西州普林斯頓大學生物醫學工程師Celeste Nelson在她的器官發育研究中採用了較低解析度的數據。她說：「我們更關心的是在上百或上千細胞的總數中找到力的大小的相對差異。然而，力的產生從根本上來說是動態的；需要在多個時間點收集這些三維數據，她說：「這樣計算量自然會暴增。」

另闢蹊徑

一些研究人員選擇了一種更簡單的方法，他們使用小而設計精準的各種聚合物晶元，直接讀出細胞力。馬薩諸塞州波士頓大學的生物工程師Christopher Chen及其同事研發出的一種設計被廣泛使用。這種晶元採用彈性材料PDMS製作，在基底上排布著柔性微柱陣列，類似於牙刷上的刷毛。微柱頂端使用ECM蛋白修飾，幫助細胞粘附。Chen實驗室的前博士後Jianping Fu說：「它們基本上就像迷你彈簧，通過測量微柱的偏斜，人們能夠識別和測量細胞施加在單個微柱上的力。」 目前他在密歇根大學安娜堡分校使用類似的設備研究人類幹細胞。

實驗陣列中的可彎曲微柱，它們可以被測量，並與細胞的蛋白骨架進行比較。

Reprinted from H. Van Hoorn et al. Nano Lett.14, 4257–4262 (2014).

微柱陣列數據比TFM的實驗結果更容易解讀，需要的計算分析也更少，而且這種晶元的製作是相當簡單的。它們也可以與熒光顯微鏡聯用，這有利於對產生細胞力的活動進行分子尺度的研究。然而，這些陣列也在細胞和其基底的交互作用當中強加了一個特殊的但是非自然的模式——由微柱的分布和尺寸決定，這可能會與細胞在活體中的行為存在偏離。

研究人員還可以通過調整微柱陣列的設計來定製細胞培養表面。較短、較粗的微柱更為堅硬且不容易彎曲，反之，較長、較細的微柱則更為柔軟，對力有更為敏感的響應。這種微柱表面剛性的改變能夠引起不容忽視的細胞骨架重組 — 細胞骨架指的是形成細胞的物理基礎結構並幫助其傳遞響應力的蛋白質網路。這反過來又可以影響到細胞的增殖、運動和成熟。

例如，Fu已經發現了表面剛性與成體幹細胞分化之間的一種關係。如果幹細胞被種在難以彎曲的樹樁樣微柱上，它們將分化成骨細胞；但是如果將其種在較高的微柱上，它們則有較大的傾向分化為脂肪細胞。通過精確地調整設計，Fu的團隊甚至能夠開發出一種非常有利於使人體胚胎幹細胞發育成為功能性脊髓運動神經元的細胞培養系統。

輕輕一拉

其他的研究人員正在使用分子感測器測量由蛋白或蛋白複合物施加的力，分子感測器會對張力的小規模改變產生響應，從而產生熒光信號。這種感測器大都是基於福斯特共振能量轉移（FRET，又名熒光共振能量轉移）。FRET指的是當一個熒光分子或熒光團與另一個熒光分子或熒光團物理距離相近時，一個激發另一個的現象。

遷移中的細胞施加的牽引力圖。

Nikolce Gjorevski

Grashoff在弗吉尼亞大學生物醫學工程師Martin Schwartz的實驗室擔任博士後期間，和同事們一起開發了第一批基於FRET的張力感測器之一，此項成果發表在了他們2010年的文章中。Grashoff說：「我們的想法是，我們可以用這種在蜘蛛絲中發現的非常有彈性的蛋白質將兩個熒光團彼此連接起來。當有機械張力時，它會伸長，你可以測量減弱的FRET信號。」靜止時，蛛絲蛋白形成一個緊湊的線圈，但是輕輕一拉可以拉伸彈簧，並將兩個熒光團分開。

為了進行概念驗證，Grashoff和Schwartz將他們的感測器集成到一種名為黏著斑蛋白的蛋白質中，黏著斑蛋白是黏著斑複合物的一種組分，形成ECM和細胞骨架之間的橋樑。當他們在細胞中表達感測器蛋白時，他們觀察到，在細胞遷移過程中，隨著黏著斑的組裝和解聚，黏著斑蛋白受到了皮牛頓級的力。

原則上，FRET感測器可以被插入到各種蛋白質中，從而獲得其他方法難以收集到的測量結果。例如，幾乎很少有工具能夠定量測量細胞在組織中如何互相推拉，但是斯坦福大學的化學工程師Alexander Dunn及同事通過將Grashoff和Schwartz的FRET感測器整合到上皮鈣粘蛋白中，可以測量這些力。

感測器也可以圍繞其他連接蛋白設置，讓研究人員可以微調感測器的靈敏度。Grashoff指出，他的FRET感測器能夠選擇性地響應1-12皮牛頓的力。但他補充說，感測器仍有改進空間，因為細胞內蛋白質可能會經受高達20-30 皮牛頓的力。

但是設計和校驗這種感測器的工作量很大，而且除了力檢測以外，感測器可能會由於其它原因（如降解）而停止工作。對FRET信號的解讀也具有挑戰性，它需要仔細測量以消除假陽性。而且，將大體積的感測器插入到蛋白中也會產生一定後果，因為蛋白的功能對其結構有很強的依賴性。「你難以充分預測它的工作狀況，」Grashoff說，「你干擾了蛋白，這可能不是個大問題，但你必須得知道這個干擾程度。」

其他研究小組使用不需要插入蛋白質的感測器來測量細胞外的力。Khalid Salaita是喬治亞州亞特蘭大埃默里大學的生物物理學家，他的小組研發了幾種這樣的探針，探針的一端固定在固體表面上，例如載玻片，另一端顯示與相關細胞表面蛋白結合的生物分子。Salaita在兩端之間放置了各種各樣的接頭，用於響應不同程度的力。Salaita說：「聚乙二醇聚合物就像濕的義大利細麵條，無規則的捲曲能夠被拉伸，而DNA具有固定的二級結構。」

他的小組還使用了源於一種名為titin的蛋白質的接頭，titin能夠在肌肉中產生彈性反衝。Salaita說：「這是一個自然形成的彈簧，能夠承受更大的力。」這些基於titin的感測器足夠強大，可用於測量細胞通過整聯蛋白對其所處的微環境施加的強大的拉力，整聯蛋白是黏著斑的組成成分，黏著斑能夠產生數十皮牛頓的力 — 足以撕開較弱的DNA雙鏈體和基於聚合物的感測器。Salaita說：「整聯蛋白基本上是一種強力抓鉤，可以錨定細胞並施加廣泛的力。」

力所能及

科學家能夠測量細胞內的力，這件事本身就很了不起。由此得到的信息可能會使我們在臨床上受益。Salaita認為，在單細胞水平測量力的試驗或有助於科學家們發現能直接對腫瘤進展物理機制進行干預的更安全的藥物。他說：「腫瘤細胞的遷移和侵犯是最致命的，如果你可以關閉這個機械過程，而且讓藥物無細胞毒性，那將是一個更精準的工具。」

然而，許多的生物學問題需要在組織或器官尺度上進行探索。Nelson說：「你很難通過分離的細胞去詳細預測組織，單個細胞之間的連接對組織中的力的產生和傳遞似乎是必不可少的。」

Nelson在許多實驗中都使用工程化上皮組織，為研究器官形成所涉及的力提供了可控的、可重現的模型。其他小組使用幹細胞產生特定組織；例如，Pruitt使用源自幹細胞的心肌細胞來研究心臟病的力學生物學效應。 她說：「我們現在有很多工具，讓我們有可能從人類細胞產生出心肌細胞並加以應用，並在單細胞和微組織中測量力、位移和伸展情況。」

科學家們終於能夠探索Thompson百年假說的含義了，Nelson為此而感到激動。她說：「我認為整個領域正在表明，機械力能夠在組織發育最終形成的形式中發揮重要作用，與被激活的基因相比，如果不是機械力更重要，那起碼也是同等重要。」

然而，人們還是需要更多的工具。大多數的力測量實驗仍然是耗時的，這就限制了其實用性，例如藥物篩選這種需要對大量細胞進行平行分析的應用。Fabry組正在開發能夠自動執行和加速TFM實驗的方法。他說：「我們想同時測量三維組織中成百上千個細胞的響應。」

測量生物體中的細胞力也是一項重大的挑戰。FRET感測器提供了一種解決方案，加州大學聖塔芭芭拉分校的機械工程師Otger Campàs和他的同事們最近設計了另外一種方案。他的小組將熒游標記的油滴注射到生物體內，修飾油滴的蛋白可以連接至細胞表面。通過記錄這些液滴在細胞之間的空間中的變形情況，他們可以通過計算得到細胞施加在液滴上的三維的力。

也許最根本的是需要一些實驗技術讓科學家們能夠更精確地操縱力響應分子。例如，使單個黏著斑失活的能力（類似於遺傳學家敲除單個基因），能夠揭示分子力的時間和空間分布如何改變它們對細胞的影響。Nelson說：「這可以讓我們直接回答很多我們現在可以說是在繞著圈子解決的問題。」

Naturedoi:10.1038/nature.2017.21961

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