miRNA的RT-qPCR驗證，小夥伴兒親測，高效，便宜，不限物種

去年6月，小丫寫了這篇帖子，吸引了好多小夥伴兒用這套方法做驗證，有了困惑通過銷售轉告給小丫，小丫解答的很開心~ ~ ~

現在重新整理一下帖子，力求描述的更清晰，希望能更方便的幫助更多的小夥伴兒 ~

做了miRNA-seq，找到差異表達miRNA後，要做驗證，Taqman探針好貴，LNA也沒便宜多少~

我要做的miRNA不在商品化的探針目錄里，需要定製，貴，時間還長~

有什麼高效且經濟的方法嗎？

小丫今天推薦帶接頭的引物+SybrGreen染料法：

一步完成加polyA尾巴和反轉錄；

用miRprimer軟體設計基因特異的上下游引物，用SybrGreen做qPCR。

溶解曲線漂亮，Ct值20出頭，跟miRNA-seq趨勢一致；

小丫的小夥伴兒親測，人、小鼠、果蠅，都有效。

原理一目了然：

第一步：設計基因特異引物：

小丫喜歡把該物種的所有miRNA都設計出來，需要做哪個基因，把相應的引物複製出來就好。

1. 到miRBase下載該物種的所有miRNA序列：

Expand all，點擊你要的物種的拉丁名；

進入這個頁面：

在最下方，選擇Mature sequence，點擊select all，點擊Fetch Sequences，就獲得了該物種的所有miRNA成熟體序列。

複製，粘貼到一個文本文件中，一定要擴展名是txt的那種最簡單的文本文件，文件名一定要叫input_miRs.txt。

2. 進入https://sourceforge.net/projects/mirprimer，下載miRprimer，把這7個文件都下載到同一個文件夾，給文件夾取個名字叫miRprimer。

把第一步獲得的input_miRs.txt文件也放入miRprimer文件夾中。它一次最多計算25個miRNA的引物，所以，如果你的miRNA列表超過25個，需要分多次放入imput_miRs.txt文件當中。

註：文件名只能是input_miRs.txt，否則這個軟體不認識~~

在Windows系統下雙擊miRprimer2.exe，會有個黑色窗口閃過，沒錯，就是閃過，然後發現多出來5個文件，就是結果。不用設置任何參數，不用輸入任何命令。

所有的引物對都在result_all_primer_pairs.txt文件里，相鄰的兩行是一對引物，例如，F_3和R_2是第一對引物，F_2和R_2是第二對引物。

剛開始為了節約時間，小丫給每個miRNA合成了2對引物。

2對引物可能只有3條，而不是4條，因為共用了一條下游引物R_2。

檢測溶解曲線是否乾淨，查看Ct值是否太大。保留一個溶解曲線乾淨，Ct值低的做樣品的qPCR。

親測20個miRNA，往往是第一對引物就很好用，溶解曲線很乾凈，Ct值介於20-30之間。

有個別miRNA的兩對引物都有雙峰，又合成了第三對引物，還是有雙峰，這樣的miRNA就得換實驗方法了。

所以，推薦的策略是：每個miRNA先合成一對引物，如果不好用，再合成第2、3對引物，再不好用，換實驗方法。

最好的一對都給整理好了，在result_best_primer_pairs.txt文件里：

拿這對引物做qPCR，文章作者的成功率也很高：

第二步：合成通用的反轉錄引物和基因特異引物。

反轉錄引物序列：5』-CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN, where V is A, C and G and N is A, C, G and T.

引物合成訂單表如下：

連同第一步獲得的基因特異引物一起送公司合成，PAGE級別。

第三步：加polyA和反轉錄

反應體系如下：

1ul 10X polyA polymerase buffer（NEB, M0276S）

1ul 1mM ATP（20ul 10mM + 180ul H2O）

1ul 10uM RT-primer

1ul 1mM dNTP（NEB, N0447S, 20ul 10mM + 180ul H2O）

0.2ul 100U/200ul polyA polymerase （NEB, M0276S）

10pg to 100 ng RNA sample

complete with RNase-free water up to 10ul.

反應條件如下：

42C, 1h；95C, 5min

稀釋：

4 ~ 8 X，分裝，-20C凍存。

註：RNA的量一定要按照要求控制好，10ul體系10pg to 100 ng RNA sample，不要貪多。

總RNA里miRNA的比例的確很低，所幸Invitrogen的SuperScript III Reverse Transcriptase反轉錄效率很高。如果RNA加的太多，反而降低反轉錄效率，得不償失，切記！！

第四步，RT-qPCR

反應體系：

9ul primer（50ul 2uM Forward primer + 50ul 2uM Reverse primer + 900ul H2O）

1ul cDNA

反應條件：

95C, 5min;

95C, 15s; 60C, 30s; 40 cycles

95C, 15s;

60C, 30s;

4C, 1h

儀器：ABI StepOnePlus，用機器默認的溶解曲線程序。

註：原文使用的反轉錄酶是NEB的MuLV，親測1/3的miRNA的Ct值超過了30，改用Invitrogen的SuperScript III Reverse Transcriptase，所有miRNA的Ct值降至20出頭。

所以推薦使用反轉錄效率高的SSIII，價格貴一半，效率高2的n次方。

該方法出自文獻：

方法：doi:10.1186/1471-2105-15-29

軟體：doi:10.1186/1472-6750-11-70

protocol：10.1007/978-1-4939-1062-5_7

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