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關於病毒二代測序你必須知道的幾件事情

上周上海伯傑就細菌和真菌深度測序所能提供的技術服務進行了一個匯總,這周就病毒深度測序再聊一下一些必須了解的事情。本帖子對二代、三代測序這些基本概念不進行細述,有需要可以通過「維基百科」或「百度百科」的幫助輕易獲取相關知識。

為什麼現階段病毒測序仍舊是一個挑戰?

病毒是目前所知體積最小,結構最為簡單的生命單位。它僅有一種核酸(DNA或RNA)作為其遺傳物質,其基因組相比較其他生命體而言較小,最小單鏈RNA病毒基因組僅5kb,最大的痘病毒也只有400kb。一般而言,作為用於分析人類上億個鹼基的二代測序技術,檢測基因組只有5-400kb的病毒應易如反掌。但是二代測序技術在病毒領域的進展並不如初期預計的那樣樂觀,仍存在不少挑戰。伯傑認為可能有以下幾個原因:

1.傳染性病原體的市場比較小

利益驅動市場。在這場個體化醫療的浪潮中,各方公司博弈點首先是市場空間大,利潤高的腫瘤市場,其次是產前診斷市場,然後才是傳染病市場。而病毒測序又是傳染病市場中很小的一塊蛋糕。在初期一些研發能力強的大型公司並沒有給予這個細分市場重點關注。隨著最近一些新發病毒引起的疫情出現(且頻率有增快趨勢),傳染病對二代測序技術需求釋放,以及最重要的是腫瘤、產前市場大公司廝殺的初步塵埃落定,各方將爭奪的市場逐步轉向傳染病領域,投入該領域的研發力量也進一步增強。

2.病毒變異比較快

病毒的基因組小而簡單,變異比較快。病毒通過基因變異維持其多樣性以便更好的適應宿主,將自身基因有效的傳遞下去。這意味著針對病毒的二代測序方案更具有個性化,普適性較差。特別是新發病毒的二代測序,更是需要根據病毒特點在前期不斷摸索建庫條件。病毒的變異增加了建庫難度,打破了測序服務公司更青睞的「流水線」式操作,相比較基因組更大的細菌而言需要額外投入人力和時間,從而成為病毒測序發展的一大阻力。

3.很多病毒無法培養

與細菌測序不同,病毒測序還有另外一個難點——比較難獲得毒株。絕大多數病毒目前無法通過培養獲得含量較高的毒株。目前病毒毒株的二代測序技術相對成熟,操作相對簡便。但是在無法獲得病毒毒株的情況下,只能利用原始標本進行測序。其有兩個難點:其一,病毒含量較低。其二,背景干擾信息龐雜。特別是來自脊椎動物的病毒標本,標本中宿主基因組數據過大,相比較而言病毒信息可以算是痕量,在其中獲取目標病毒信息不亞於大海撈針。

4.全面性人員缺乏

完成病毒的二代測序不僅在實驗操作的建庫環節同時更在數據下機器之後的分析環節熟知所要進行測序的病毒的特點,這需要相關人員具有一定的病毒相關背景知識。但是這樣全面的人員目前比較缺乏。很多進行數據分析的人員並不懂實驗技術,他們只是按照大致的流程將下機器的數據「流水作業式」分析,這樣的分析肯定會漏掉一些重要的信息點。

突破病毒測序瓶頸的解決方案有哪些?

如上所述,病毒測序,特別是臨床標本的測序成為病毒二代測序領域發展的瓶頸。如何使病毒量較少的標本獲得更好的二代測序結果,如何能在大海中更精準的將這枚繡花針撈起來,可以通過兩個策略來執行。

一、富集和捕獲

這個策略是從實驗手段上去除背景干擾信息或放大目的基因。

1.富集病毒粒子

通過實驗手段在保護病毒基因的情況下去除宿主基因。主要使用離心、過濾和核酸酶降解等實驗步驟來實現目的。一般先通過離心和過濾去除一些大顆粒物質,然後用核酸酶降解標本中宿主核酸。因多數病毒有包膜或者衣殼,這些外部構造可以防止核酸酶(DNA酶或RNA酶)對其包裹核酸的降解,只要熟悉目標病毒的特性,就可以用核酸酶處理掉大部分背景宿主信息。整個過程原理並不複雜,操作也不繁瑣,唯一需要的就是經驗積累。每一步所用實驗條件和參數都要反覆摸索,確定最適合的實驗條件。上海伯傑二代測序技術顧問單老師在該領域已經耕耘多年,有著豐富的經驗。這個方法的弊端有兩個:第一,實驗條件因病毒而異,無法實現批量化。第二,需要病毒的原始標本而不是核酸。對很多傳染性病原體來說並不適用。

2.靶向捕獲病毒核酸

通過實驗手段富集病毒的核酸。

PCR擴增富集:如果客戶所感興趣的目標病毒明確,就可以利用科屬的保守引物先對病毒核酸進行擴增。比如甲型流感病毒的8個基因片段都有一個保守的序列,可以利用這個序列先對流感病毒的基因組進行擴增,將擴增放大的病毒核酸再進行建庫測序。

ThermoFisher的Ion AmpliSeq靶向測序試劑盒:2011年推出。是全球首個基於擴增子富集構建靶向DNA文庫的新一代測序方法。能夠幫助研究人員從低至1ng的低質量DNA和RNA樣品中捕獲、富集、檢測和研究特定的生物標記物,並在單次檢測中同時檢測SNP、Indel、CNV和fusion的情況。該試劑盒由一個寡核苷酸引物池組成,每一對引物可以擴增指定的基因組區域。該技術允許在單次PCR反應中同時擴增多達24,000個引物對,一次可以擴增幾個到幾百個靶向基因。在對選定基因組區域進行簡單的PCR擴增,消化剩餘的引物後,將擴增子經過連接接頭等製備,即可完成文庫構建進行測序。該技術雖然不是單獨為微生物研究領域開發的,但是可以用於病毒測序領域。

羅氏VirCapSeq-VERT靶向捕獲試劑盒:2017年推出。該試劑盒是使用生物素標記的寡核苷酸探針序列,對目前已知的可以感染脊椎動物的207種病毒種類設計了2百萬個探針進行捕獲。其可以富集病毒到100-10000倍。尤其適合背景信息比較複雜的臨床標本,如全血、血清、組織,更適合來自人類的咽拭子、痰液和肺泡盥洗液等標本。該試劑盒也可以捕獲到未知病原體(新病毒),相應的參考文獻地址為:http://mbio.asm.org/content/6/5/e01491-15.full.其整個實驗流程為:

二、大數據分析

這個策略是從數據分析手段上去除宿主背景信息。

因上述描述的實驗操作要麼需要實驗操作人員有豐富的經驗,要麼是新品目前階段處於一個摸索階段,尚未成熟。一般開展病毒二代測序服務的公司會直接使用數據分析來處理病毒二代測序瓶頸。公司會將按照一般測序流程進行建庫,上機檢測。在檢測室選擇Hiseq平台將標本進行大數據量的測序,一般是10G以上數據量。然後利用生物信息分析在如此大的數據量中去除宿主相關信息,獲得病毒基因組信息。這個方法有一個弊端:其一是因為大多數是宿主基因組信息,在前期做數據質量控制(QC)步驟中將會把一些病毒基因組信息去除;其二是使用Hiseq平台,其每個reads讀長短,拼接過程中會引入一些序列誤差,這些誤差對幾億bp的宿主基因組可能作用不大,但是對基因組只有幾千bp的病毒來說所佔的比例就比較高;其三是很多臨床標本抽提核酸之後質量並不符合建庫標準,導致無法使用該方法進行操作。

測序平台品牌如何選搭?

很多客戶在準備購買測序平台的時候,不知道選擇哪個品牌,常遇到一些諮詢。其實最適合的才是最好的,每個平台都有其優勢所在。下面伯傑就給各位分析一下常用的這兩個平台。

1.ThermoFisher的Ion系列

Thermofisher的二代測序儀器面市較早,其IonPGM和Proton測序平台在最早的一批用戶中覆蓋度較高。目前賽默飛又推出了IonS5和IonS5XL兩款NGS系統,該測序系統可以在24小時內完成從DNA到數據獲取的完整靶向測序流程。該平台的設計理念是「即插即用」,例如墨盒式的加樣簡化了測序前的設置流程,加樣、建庫、模板製備等手動時間僅需45分鐘。IonS5和S5XL有著簡捷、靈活、快速、低樣本輸入量、數據分析存儲簡易5大特點。其缺點是標本建庫步驟相對較多,適合一次標本檢測需求量不是很多的用戶。優點是上機時間短,數據分析方面支持力度大。有突發應急測序和檢測任務的公共衛生體系客戶更傾向於選擇這個平台。

2.Illumina的以Miseq為代表的系列平台

目前Illumina的測序儀器在整個市場佔有率達到70%以上。雖然他家機型不斷的推陳出新,但是在病原體測序領域Miseq平台一直使用率較高。Illumina測序平台前期建庫步驟相對簡化且開放度很高,可以兼容多家建庫試劑,比如NEB、KAPA、Bioline等。這正是Illmina的高明之處,面對種類繁多要求各異的測序樣品,建庫的兼容性高可以增加客戶選擇性,提高使用黏附度,會讓更多客戶在選擇使用之時優先考慮Illumina的測序平台。

針對病原體測序技術這塊來說,Miseq平台優點是建庫步驟少,缺點是上機時間長,適合日常有較多檢測標本且對檢測周期沒有過多要求的客戶。目前提供病原體測序服務的公司多以Miseq平台為主。

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