香莢蘭國際標準：第二部分 檢測方法-ISO 5565-2：1999

國際標準ISO 5565-2:1999（E）

墨西哥香莢蘭

第二部分 檢測方法

1範圍

本國際標準ISO 5565規定了墨西哥香莢蘭的檢測方法。

本國際標準ISO 5565適用於香莢蘭、香莢蘭切段和香莢蘭粉，但不適用於香莢蘭提取物。

本國際標準ISO 5565介紹了三種檢測香莢蘭的方法。

a)香莢蘭和香莢蘭粉含水量的測定（4.1）；

b)高效液相色譜法測定香蘭素、香蘭酸、對羥基苯甲醛和對羥基苯甲酸（4.2）。

c)紫外分光光度法測定香蘭素的含量（4.3）。

註：香莢蘭的規格已在ISO 5565-1中作了說明。

2參照標準：

本文引用的標準所包括的條文組成了本國際標準ISO 5565的條文，對於以前的參考，以及後來修改和補充發行的版本都不適用。歡迎各方人士對本國際標準ISO 5565的最新版本條文的適用性進行調查。對於現行參考標準，最新版本的條文已進行引用。ISO和IEC成員保留對現行國際標準的解釋權。

ISO 1042：實驗室玻璃製品----單標容量瓶。

3定義

以下定義適用於本國際標準ISO 5565：

3.1含水量

是採用本國際標準ISO 5565所規定的方法所帶走和收集的水量。

註：通常用質量百分比來表示[%,(m/m)]。

4檢測方法

4.1香莢蘭和香莢蘭粉的水分含量測定

註：ISO 939中的一般方法不適用於香莢蘭

4.1.1原理

用共沸蒸餾法測定水分含量。使用不能與水混溶的有機液體，將水分收集在有刻度的試管內。

4.1.2試劑

所用試劑應為確認的分析純試劑，所用水應為蒸餾水、去離子水或與之純度相當的水。

4.1.2.1甲苯

在甲苯內加少量水，搖蕩使甲苯達到飽和，然後蒸餾。使用餾出液測定水分。

4.1.3儀器

常用的實驗室儀器，特別的是：

4.1.3.1蒸餾器：包括一個能用適宜方法加熱的玻璃燒瓶和一個迴流冷凝器。迴流冷凝器將冷凝液排入與燒瓶相連的接收器。

接收器、冷凝器和燒瓶之間都應以可互換的磨口玻璃接頭連接。接收器用於收集和計量冷凝水，並把溶劑送回到燒瓶。儀器的裝配如圖1所示。各組成部分敘述如下。

4.1.3.1.1燒瓶

容量500ml，形狀如圖1所示。用耐熱玻璃製成，退火良好。儘可能沒有條紋和類似的各種缺陷。

4.1.3.1.2迴流冷凝器

水冷式，用玻璃製成，套管約400mm長，內管直徑9.5—12.5mm。

插入接收器內的冷凝器末端可與冷凝器垂直軸成30度的尖角。蒸餾條件建立後，插入接收器的冷凝器尖端應離液面6--7mm.

4.1.3.1.3接收器

容量5ml，用耐熱玻璃製成，退火良好，儘可能沒有條紋和類似的各種缺陷。備有磨砂玻璃接頭，其形狀、尺寸和公差列於圖1.

接收器基本上由一個上部小腔、導向燒瓶的一個管子和磨砂接頭以及刻度管組成。刻度部分的容量最高刻度為5ml。

刻度範圍從0至5ml，間隔0.1ml。相當於每一毫升處的刻度應圍繞試管四分之三，其餘進位刻度處的刻度則圍繞試管一半。每毫升的誤差不超過0.05ml。

4.1.3.1.4熱源

油浴或者是備有滑動變阻器或其他能控制熱量的電熱管。

油浴中油的溫度不應比甲苯的沸點高得太多。

4.1.3.1.5銅絲

長度足以通過冷凝器，一端彎曲成螺旋形。

螺旋的直徑以能緊貼接收器刻度部分的內部但仍能上下移動為宜。

4.1.3.2分析天平：精確到0.01g。

4.1.4試樣的製備

4.1.4.1香莢蘭、切段香莢蘭、混合香莢蘭

將莢剪成5mm以內的碎片，注意不要改變水分含量。

4.1.4.2香莢蘭粉

將樣品混勻

4.1.5操作步驟

4.1.5.1儀器的準備

用重鉻酸鉀-硫酸洗液清洗整個儀器，使冷凝器和接收器表面附著的小水滴盡量少，然後用清水徹底沖洗，並在使用前充分乾燥。

4.1.5.2試樣

稱取約10g試樣（4.1.4），精確至0.1g，務使收集的水分不超過4.5ml。

4.1.5.3測定

將試樣（4.1.5.2）用甲苯（4.1.2.1）定量地移入蒸餾燒瓶（4.1.3.1.1）內。加足量的甲苯（全部約75ml）將樣品完全浸沒，用手回蕩使之混勻。裝好儀器並將甲苯裝滿接收器（4.1.3.1.3），也就是使甲苯通過冷凝器（4.1.3.1.2）直至溢出而流入蒸餾燒瓶為止。必要時在冷凝器的頂部塞一團鬆鬆的棉花，或接上一支氯化鈣小試管，以防止大氣中的水分凝結在冷凝管內。

為了控制迴流，用布包住燒瓶和通向接收器的管子以絕熱，加熱燒瓶，使蒸餾速度為每分鐘大約100滴，當大部分水分蒸餾出來後，增加蒸餾速度至每分鐘大約200滴，繼續蒸餾，直至再也收集不到水分為止。在蒸餾期間，偶爾要用甲苯（每次約5ml）洗下附著在冷凝器壁上的水分。

偶爾將一個銅螺旋絲在冷凝器和接收器中上下移動，這樣可使接收器中的水分從甲苯中分離出來。水分沉降在接收器的底部。繼續迴流，直至接收器中的水平面在30min內保持不變為止，然後關閉熱源。必要時用甲苯沖洗冷凝器，並用銅螺旋絲排去任何水滴。

將接收器浸入處於室溫下的水中至少15min或者到甲苯層明晰，然後讀取水的體積。

4.1.6結果的表述

水分含量： w 以重量百分數表示，等於：

w=100V/m

式中： V----收集到的水分的體積，ml；

m----試樣的克數

假定水的密度正好為1g/ml。

4.2高效液相色譜法測定香莢蘭、香莢蘭切段、混合香莢蘭、香莢蘭粉中香蘭素、香蘭酸、對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸的含量。

4.2.1原理

測試品經提取或者稀釋（如有必要），用高效液相（HPLC）分離，添加內標，採用紫外分光光度法進行測定。

4.2.2試劑

所用試劑應確認為分析純試劑，所用水為蒸餾水、去離子水或純度與之相當的水。

4.2.2.1乙醇，96%（V/V）溶液

4.2.2.2甲醇

4.2.2.3稀磷酸溶液，c(H3PO4)0.01mol/L

4.2.2.4流動相

75%稀磷酸溶液（4.2.2.3）與25%的甲醇（4.2.2.2）混合，用濾膜過濾（4.2.3.3），脫氣。

4.2.2.5參考標準，純度不低於99%。

4.2.2.5.1香蘭素

4.2.2.5.2香蘭酸

4.2.2.5.3對羥基苯甲醛

4.2.2.5.4對羥基苯甲酸

4.2.2.6內標：水楊酸，純度不低於99%

4.2.2.7標準貯備液：能較好地與流動相混溶。

4.2.2.7.1香蘭素貯備液：濃度為1g/L，稱量精確至0.001g。

4.2.2.7.2香蘭酸貯備液：濃度為0.1g/L，稱量精確至0.001g。

4.2.2.7.3對羥基苯甲醛貯備液：濃度為0.1g/L，稱量精確至0.001g。

4.2.2.8參考溶液

貯備液經流動相稀釋得到參考溶液，濃度見4.2.2.8.1至4.2.2.8.4所述。

參考溶液可在暗處，4℃下保存幾天時間。

4.2.2.8.1香蘭素參考溶液，濃度為0.1g/L

4.2.2.8.2香蘭酸參考溶液，濃度為0.008g/L

4.2.2.8.3對羥基苯甲醛參考溶液，濃度為0.008g/L

4.2.2.8.4對羥基苯甲酸參考溶液，濃度為0.002g/L。

4.2.2.9內標標準溶液

水楊酸溶於流動相，濃度為0.6g/L，稱量精確至0.001g。

註：應與樣品的濃度一致。

4.2.3儀器

實驗室常用設備。特別的是：

4.2.3.1氣密磨

4.2.3.2單標容量瓶：容量為100ml和200ml，應符合國際標準ISO1042的要求。

4.2.3.3濾膜，0.45微米孔徑。

4.2.3.4連續提取器：索氏，由以下構成：

4.2.3.4.1索氏提取器：容量為125ml

4.2.3.4.2冷凝器

4.2.3.4.3燒瓶，250ml，磨口

4.2.3.4.4柱子套件

4.2.3.4.5熱源：電熱套或者油浴，由帶有調溫斷路器的滑動可變電阻器或者其它熱控裝置控制。

4.2.3.5高效液相色譜，由以下構成：

4.2.3.5.1光譜檢測器：可在254nm波長測定

4.2.3.5.2進樣裝置：可介入10-100ul試樣

4.2.3.5.3色譜柱：C18柱，粒徑5-10um

4.2.3.6注射器：高效液相色譜用

4.2.3.7分析天平：精確到0.001g。

4.2.4樣品製備

4.2.4.1香莢蘭、香莢蘭切段、混合香莢蘭

將樣品磨碎、混勻。

4.2.4.2香莢蘭粉

樣品混合均勻。

4.2.5小試樣

稱取20g已製備樣品（4.2.4.1或者4.2.4.2），精確到0.001g。

4.2.6抽提

用約200ml乙醇（4.2.2.1）在抽提器（4.2.3.4）中抽提小試樣（4.2.5）16小時，即溶劑迴流25到30。

用提取溶劑抽提香莢蘭或香莢蘭粉得到最大濃度為100g/L的提取物。將提取注液移入200ml容量瓶（4.2.3.2）中，再用少量乙醇洗滌抽提器數次，將洗液都倒入容量瓶。

加乙醇稀釋到刻度，混勻，配製成已知滴定度的溶液。

用流動相（4.2.2.4）稀釋得到1：10的溶液。

4.2.7操作步驟

4.2.7.1色譜條件

常溫、常壓，流動相速率為1ml/min，在4.2.3.5的條件下進行測定。

4.2.7.2校正

4.2.7.2.1分別注入參考標準及內標，再混合進樣。調整操作條件，使所有化合物相應的峰所得的相關係數趨近於1.

4.2.7.2.2用濾膜（4.2.3.3）過濾後將4.2.6中所製備的樣品進樣，確認內標對樣品的成分沒有影響。

4.2.7.2.310ml標準溶液（4.2.2.7）與10ml內標溶液（4.2.2.9）混合，過濾後進樣。

響應係數（Ki）由以下方程式表示：

Ki=mi×hs/ms×hi

其中

Ki是被測定組分的響應係數；

mi是進樣溶液中i組分的質量；

ms是進樣溶液中內標物的質量；

hi是色譜測定所得到的i組分的峰高；

hs是色譜測定所得的內標物的峰高。

註：上式中，峰高可用峰面積表示。

4.2.7.3測定

4.2.7.3.110ml樣品溶液（4.2.6）和10ml內標溶液（4.2.2.6）混合、過濾

4.2.3.7.2在4.2.7.2.3描述的條件下將4.2.7.3.1製得的溶液進樣。

所測物質的百分含量由下式計算：

mi= Ki×hi×ms/hs

各符號所代表的如4.2.7.2.3所示。

註：上式中，峰高可用峰面積表示。

4.3紫外分光光度法測定香莢蘭、香莢蘭切段、混合香莢蘭、香莢蘭粉中香蘭素的含量

4.3.1原理

小試樣中所含的香蘭素由乙醇溶液提取。

用分光光度法測定乙醇溶液中香蘭素的含量。

4.3.2試劑

所用試劑均應為確認的分析純試劑，使用的水應為蒸餾水或純度與之相當的水。

4.3.2.1乙醇：96%（V/V）溶液，用於紫外分光光度法的測定。

4.3.2.2氫氧化鈉溶液：c(NaOH)≈1mol/L

4.2.3.3香蘭素

4.3.3儀器

常用的實驗室設備，特別的是：

4.3.3.1氣密磨

4.3.3.2單標容量瓶：容量為100ml，250ml，應符合國際標準ISO1042的要求。

4.3.3.3吸移管：10、20和25ml三種規格。

4.3.3.4乾燥器：內盛有效的乾燥劑

4.3.3.5抽提器：按4.2.3.4至4.2.3.4.5要求。

4.3.3.6分光光度計：適於在紫外光譜區進行測定

4.3.3.7石英池：作分光光度測定時用，光徑長度1cm

4.3.3.8稱量瓶：配備有不漏氣的瓶塞，容量為25ml

4.3.3.9進樣器：高效液相色譜用

4.3.3.10分析天平：精確到0.001g

4.3.4操作步驟

4.3.4.1香蘭素比吸光度的測定

4.3.4.1.1標準溶液的配製

用稱量瓶（4.3.3.8）稱取預先在乾燥器（4.3.3.4）中乾燥的香蘭素（4.3.2.3）約30mg，精確至0.001g，加約20ml乙醇（4.3.2.1）溶解，定量移入250ml容量瓶（4.3.3.2）中。用乙醇洗滌稱量瓶數次，將洗液倒入容量瓶。補加乙醇至刻度並混勻（溶液A1）。

用吸管吸取25ml的溶液A1於100ml容量瓶（4.3.3.2）中。加乙醇至刻度並混勻（溶液B1）。

用吸移管吸取10ml的溶液B1於100ml容量瓶中，加約60ml乙醇和2ml氫氧化鈉溶液（4.3.2.2），混勻。再補加乙醇至刻度並混勻（溶液C1）。

4.3.4.1.2參考溶液的配製

用吸移管吸取2ml氫氧化鈉溶液（4.3.2.2）於100ml容量瓶中，加乙醇至刻度並混勻。

4.3.4.1.3測定

用分光光度計（4.3.3.6）和石英池（4.3.3.7），記錄參考溶液（4.3.4.1.2）和溶液C1在250-420nm波長範圍內的光譜。

4.3.4.1.4計算

最大吸收作用發生在波長為350±3nm處，其吸光度應在0.2至0.8之間。

從約270nm到380nm處劃一條基線。

記錄最大吸光度（Amax）和在相同波長下基線的吸光度（Abase）。

按下列公式計算香蘭素的比吸光度（E1%）

E1%=100（Amax- Abase）/m

式中：m為用於配製溶液的香蘭素的克數，以毫克為單位。

4.3.4.2試樣製備

4.3.4.2.1香莢蘭

將香莢蘭磨碎或切成小塊，混勻。

4.3.4.2.2香莢蘭粉

將樣品混勻。

4.3.4.3小試樣

稱取約20g（4.3.4.2.1或4.3.4.2.2）樣品，精確至0.01g。

4.3.4.4抽提

用約200ml乙醇（4.3.2.1）在抽提器（4.3.3.5）中抽提小試樣（4.3.4.3）16小時。抽提液移入250ml容量瓶（4.3.3.2）中，再用少量乙醇洗滌抽提器數次，將洗液都倒入容量瓶（4.3.3.2）。加乙醇至刻度並混勻（溶液A2）。

4.3.4.5參考溶液的配製

用吸移管吸取2ml氫氧化鈉溶液（4.3.2.2）於100ml容量瓶（4.3.3.2）中，加乙醇至刻度並混勻。

4.3.4.6測定

用吸移管吸取25ml溶液A2於100ml容量瓶中，加乙醇至刻度並混勻（溶液B2）。

用吸移管吸取20ml溶液B2於100ml容量瓶中，加乙醇至刻度並混勻（溶液C2）。

用吸移管吸取10ml溶液C2於100ml容量瓶中，加約60ml乙醇和2ml氫氧鈉溶液（4.3.2.2）。再補加乙醇至刻度並混勻（溶液D2）。

用分光光度計（4.3.3.6）和石英池（4.3.3.7），記錄參考溶液（4.3.4.5）和溶液D2在250-420nm波長範圍的光譜。

4.3.4.7測定結果的表示

香蘭素含量（以樣品的重時百分數表示）等於：

wv=5000（Amax-Abase）/E1%×m

式中：Amax為最大吸光度

Abase為在相當波長下基線的吸光度；

E1%為香蘭素的比吸光度（4.3.4.1.4）

m為用於抽提的小試樣品的克數。

如果要示以干物質含量為基準表示測定結果，則需將製品的水分含量考慮在內。

5檢驗報告

4.1、4.2、4.3描述的三種方法的檢驗報告應包括：

--驗證樣品所有必要的信息

--如果知道，寫出取樣方法

--本國際標準ISO 5565中所採用的檢測方法

--所有可能影響檢測結果的本國際標準ISO 5565中沒有規定的或者可選的具體操作

--獲得的檢測結果，並寫明是干物質或者不是

--如果進行複檢，寫出最終引用的結果。

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