CAR-T與TCR-T已在高速通道

摘要

修飾化細胞轉移（ACT）領域目前由兩部分組成： CAR工程T細胞與TCR工程T細胞。此領域目前已經從基礎免疫學原理轉變為具有範式流變的臨床免疫治療。在ACT技術中，利用基因工程使T細胞表達人工合成受體，繼而識別目標細胞，這對治療癌症來說是一種激動人心的新方法。而且同樣有希望的是，這種技術還能用於治療慢性感染疾病和自身免疫病。使用人工合成生物學的原則，免疫學與基因工程方面的進展，使我們可能製造特定的人類T細胞，這些細胞能具備我們想要的特性和加強的某些功能。在晚期B細胞白血病與淋巴瘤的病人中，使用CD19特異性的CAR-T細胞進行臨床試驗，結果顯示在成人和兒童 身上均取得了持久的治療效果。由於最近製藥行業進駐此領域，工程T細胞廣泛可得的前景正飛快地變得明朗起來。在這篇綜述中，我們將討論目前ACT領域所面臨的機會與挑戰。點擊文末「閱讀原文」報名參加本期在線交流！

一、介紹

目前有三類使用效應T細胞的ACT技術正走向葯監部門的許可之路（圖一）。腫瘤滲透淋巴細胞（TIL）的研究在過去的幾十年里一直緩慢但持續地向前推進。最近，國際上有一個三期臨床的隨機試驗已經開始，主要針對轉移期的黑色素瘤。萊昂生物科技已經成立，該公司將對黑色素瘤和其它具有合適TIL的腫瘤開展商業化的TIL療法。

不同於TIL療法，建立在基因轉移基礎上的治療策略是為了克服腫瘤特異性T細胞庫的免疫耐受。這些方法可以把T細胞導向某些組織，要麼依靠轉移CAR，後者含有融合的抗體結合域和T細胞信號傳遞域；要麼依靠轉移表達TCR α/β 異源二聚體。基因修飾後的T細胞注射回到人體，然後特異性地導向靶標，這樣就有可能提供一種具有反應活性的免疫系統，而這種可能性在自然條件下是不存在的。這種方法還具有一個快速根除腫瘤的好處，這種好處常見於具有細胞毒性的化學治療或者靶向治療等療法中，而不見於具有滯後效應的疫苗和T細胞檢查點療法中。

二、ACT在HIV-1 感染和其它慢性感染疾病中潛在的作用

值得一提的是，最早一批形式的ACT是二十年前使用基因修飾後的T細胞在晚期HIV-1/AIDS病人身上完成的。HIV-1病人身上的這些試驗結果也促成癌症領域ACT療法的概念形成。今天，HIV-1/AIDS領域面臨的挑戰是如何使用細胞療法去根除那些對病毒療法產生抗藥的HIV-1病毒。最近柏林的Gero Hutter及其同事通過同源移植和ACT治癒了一位HIV-1感染者，給領域同仁極大鼓舞。目前有很多辦法誘導細胞內在性的抗HIV-1感染，同時採用基因修飾化ACT去除剩下的HIV-1的細胞群。

三、工程改造調節性T細胞（Tregs）

現在有越來越多的興趣想利用Tregs下調那些不需要的免疫反應。這個方法已經在自身免疫病和移植排斥的臨床前模型研究中得以證實。在在Tregs上，合成工程改造的基本原則已經獲得成功應用。在Tregs上使用CAR，就是通過CAR將Tregs導向目標組織並在該處產生抑制自身免疫。

四、動物模型在ACT中的作用

動物模型在開發細胞療法的過程中起著關鍵作用。動物模型主要有兩種：一種是使用小鼠T細胞和小鼠抗原的同質動物模型；另一種是使用人類T細胞和人類腫瘤細胞在免疫缺陷小鼠上的異源移植動物模型。在開發細胞療法的幾十年中，這些動物模型經常會產生一些前後矛盾和互相衝突的結論。一個主要原因是細胞療法背後的可變因素太多導致。

同質小鼠模型保留著完整免疫系統的內在優點，而異源移植模型則具有測試人類細胞的優勢。異源移植模型在幾個報告中精確地預測過CAR的療效，但沒有預測到任何毒性，包括CRS。同質小鼠模型也預測了某些療效，不過也沒有模擬出CRS。

更複雜的人源化小鼠如MISTRG能提供物種特異性細胞因子來支持人類細胞，改進有些人類細胞的移植，可能會模擬人類細胞試驗帶來的藥效和毒性。

五、發現最佳的CAR設計方案

CAR設計在過20年中一直在改進（圖2）。1991年有三個實驗室報告了第一代CAR設計方案。Roberts與Finey首先設計了第二代CARs，其中包含了CD28 或4-1BB信號域。在臨床前試驗中，其他人發現了4-1BB比CD28療效好。綜合幾個研究，一個比較謹慎的結論是，並不是某一個人類胞內域一定好於另一個，而是CD28信號對產生臨床有效的T細胞非常關鍵，而4-1BB則利於維持CAR-T細胞。

六、關於ACT毒性的思考

在過去十幾年中，許多使用ACT的臨床試驗都顯示各種工程細胞很安全，但療效甚微。在過去四年里，在療效方面ACT經過了一個革命性的轉變。這表現在T細胞在工程改造後能在體內擴增，並且在某些情況下能長期存在。這些新進展極大地改變了ACT的療效，尤其是在CAR-T方向。但是也如CAR-T應用於癌症治療時，在有療效的同時也伴隨著毒性。

1．細胞因子釋放風暴（CRS）

CAR-T 用於骨髓來源的腫瘤時最顯著的毒性就是CRS。高度擴增的T細胞會產生CRS，包括高燒、肌肉疼痛、低血壓以及呼吸停止等。而這種CRS在臨床前動物模型中並沒有出現。一個比較重要的現象是IL-6的大量表達，所以用IL-6阻斷法如IL-6受體拮抗劑Tocilizumab可以緩解重度CRS。另一個重要的現象是重度CRS幾乎都是發生在重症病人身上，所以CAR-T細胞如果能在這些病人的疾病早期移植進去的話，重度CRS的風險會小得多。

2．中靶毒性

中靶毒性是指毒性是來自工程改造T細胞的抗原特異性。一個例子是腫瘤裂解綜合征，由腫瘤細胞被破壞直接導致。另一個例子是B細胞萎縮，這是因為B細胞表達CD19，而由靶向CD19的CAR-T細胞導致。最近有兩個有工程改造T細胞導致的致死毒性的案例報告。在這兩個案例中，毒性都是因為抗原靶標在正常組織中的表達。

3．神經學毒性

另一個出乎意料的而且還無法解釋的現象是伴隨著白血病的CAR-T細胞治療會出現神經學癥狀。這些癥狀似乎不能為Tocilizumab所緩解。這些癥狀的機制和發生組織還有待進一步闡明。

4．其它類型的毒性

注入激活的T細胞會引人自身免疫風險。治療黑色素瘤的ACT引起過白癜風。激活的T細胞移植引起過皮疹、結腸炎、下垂體炎等等。不過對CAR-T療法，目前還不是一個很顯著的問題。

七、目前ACT領域所面臨的問題

目前還有不少科學和工程上的挑戰需要實驗去研究解決。下面我們就其中的幾個予以討論。

1．細胞產品的組成成分

細胞療法在開始時主要是注射高度分化的CD8+細胞，這些CTL在注入人體後有最佳的細胞毒性，但沒有足夠的複製能力。 現在已經公認CD4+ 需要經常和CD8+ 一起使用，很可能是CD4+T淋巴細胞能提供生長因子和其他信號因子以維持注入的CTL的存活和功能。

現在有一個問題是：是否應該把病人身上獲得的細胞亞群使用流式或其它手段進行分離，並且將它們分開培養？因為CD4+ 和CD8+ 細胞的最佳培養條件是截然不同的。而且，分離手段的使用也可以去掉Treg，因為Treg的存在會影響到使用T效應細胞的細胞療法。另一個應該進一步分離的原因是在白血病病人的T細胞中，需要除掉癌症細胞。但是，細胞操作會增加很多費用。

2．年輕還是年老？

和上述問題相關的一個問題是什麼是注入T細胞的最佳分化狀態？人類和小鼠中的研究顯示未致敏或者中心記憶T細胞更好用。這裡有一個挑戰就是，在那些年齡大的患者中，他們只有非常少量的未致敏T細胞，而且這種問題會因為化療或疾病其它方面的原因會變得更加嚴重，那麼如何在這些病人中提取上述的細胞是一個大的挑戰。

我們的研究表明細胞的複製能力是預測成功與否最重要的一個標誌物。一個辦法是從全血中分離上述兩種細胞。但是有一種更為簡單的、更具魯棒性的方法是使用大量T細胞，然後使用一種培養條件，這種條件更適合未致敏和中心記憶T細胞的生長和維持。

3．是否有一個整齊劃一且是最佳的最終細胞產品公式？還是不同癌症會不一樣？

目前還不知道CD19 CAR-T細胞在治療B細胞血癌上出乎意料的成功是否能在其它實體瘤病人得到重演。我們發現CAR-T細胞能在體外殺死腺癌細胞。但不清楚是否需要優化細胞組成和培養條件。對於實體瘤來說，在諸多方面顯然和血液癌不一樣，如何使用好CAR-T細胞療法還需要做很多細緻的工作。

4．在CD4+ 和CD8+ T細胞亞型中最佳共刺激域是一樣的嗎？

以前有研究表明不同T細胞亞群所需的最適培養條件會截然不同。這產生的一個問題就是不同的工程T細胞是否需要裝上不同的信號域？我們曾經比較CD28，4-1BB， 和 ICOS這些結構域在人類CD4和CD8 T細胞中的不同效果。我們發現ICOS信號域在CD4 CAR-T細胞中更好用，而4-1BB在CD8 T細胞中更好用。

5．生死攸關的問題（去還是留）：自殺性構建將會減輕脫靶毒性嗎？

也許工程T細胞療法最大的不確定是：工程改造誘導的新特異性和加強的效應功能是否會產生意料之外的脫靶毒性。中靶但脫瘤的毒性在CAR-T細胞療法中發生過，而脫靶毒性在TCR-T細胞療法中也發生過。有很多種辦法可以減輕毒性反應。我們發現如下這些辦法是可行的。如使用CAR的mRNA，如使用各種方法誘導工程T細胞進入細胞凋亡等等。相信這些辦法可以幫助T細胞療法獲得更為嚴格的安全指數。

八、結論

鑒於目前正在進行的治療試驗，使用人工合成的CAR和TCR工程改造T細胞的療法將會得到廣泛的商業許可。華爾街的資源介入使得這個領域擺脫以前資源有限的局面，而大踏步向前發展。現在我們有能力對可以注入人體的T細胞進行增加或減少基因的操作，這些都會增加更多的可供選擇的細胞產品種類，可以用來克服腫瘤微環境中的免疫抑制，甚至可能最終不需要目前通過抗體阻斷而獲得的免疫檢查點療法。更為高級的基因工程改造技術和ACT結合起來，將會引起巨大的進步，使我們能將合成生物學的基本原理運用到治療癌症、慢性感染病和自身免疫病。

參考文獻：

Barrett DM, Grupp SA, June CH. Chimeric Antigen Receptor- and TCR-Modified T Cells Enter Main Street and Wall Street.J Immunol. 2015 Aug 1;195(3):755-61.

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