SCI 文獻解析揭示如何進行蛋白質轉運研究

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什麼是蛋白質轉運？

除了少量的蛋白質由線粒體和葉綠體 DNA 編碼外，其餘蛋白質都是由細胞核 DNA 編碼，在細胞質游離/吸附的核糖體上合成。

細胞要發揮正常功能，必須使每一個蛋白質都要在膜（細胞膜，細胞器膜）或水相腔室（細胞質，細胞器基質或內膜腔）中正確定位。

如受體蛋白、離子通道蛋白和轉運蛋白需要嵌在質膜內。DNA、RNA 聚合酶需要運送到核里。蛋白酶和過氧化氫酶應分別轉運至溶酶體和過氧化物酶體。其他如細胞外間質和激素則需要分泌到細胞外。

也就是說蛋白質轉運是

* 細胞內將新合成的蛋白分類，修飾並運輸到正確目的地的過程。

* 可以將蛋白質轉運形象化類比為街道上移動的交通工具：多方向運動，遵守交通規則，高度動態，每個都具有一個最終目的地。

* 蛋白質轉運/蛋白質定位/蛋白質分發，這三個術語在文獻中是可以互換的。 蛋白質轉運主要有兩條路徑：內吞和外泌。

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為什麼要研究蛋白質的轉運？

* 幫助我們了解細胞穩態的關鍵機制，蛋白質-蛋白質相互作用，翻譯後修飾和細胞間的相互作用。

* 解釋人類疾病發病機理，如亞細胞蛋白質轉運發生錯誤，將會發生「轉運異常疾病」，目前為止，已經發現超過 30 種轉運異常疾病，囊性纖維病是最具代表性之一。這些疾病包括但不僅限於代謝、神經病變和癌症疾病。

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如何研究蛋白質轉運？

研究方法主要有以下幾類

* 放射自顯影（脈衝追蹤 + 電子顯微鏡）

* 綠色熒光蛋白（GFP）+ 顯微鏡檢查

* 突變體 + 綠色熒光蛋白（GFP）

* 生化分析和無細胞系統

* 亞細胞結構分離 + Western，IP，交聯質譜技術（XL-MS）

其中亞細胞結構分離 + Western，IP，交聯質譜技術（XL-MS）是目前最常用的方法。

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亞細胞結構分離方法研究蛋白轉運應用舉例

Example A. ULBP2 Trafficking Blockage

Leung WH., et al （2015）。 J. of Immunol., Spin Column-Based Fractionation.

Leung 等人[1]研究 PRL-3 對 ULBP2 蛋白轉運的影響。人結腸癌細胞系 HCT116 使用 40uM PRL-3 處理，然後使用離心管柱法進行亞細胞結構分離。

結果顯示，細胞質膜，細胞器和細胞漿組分被徹底分離，經過化學處理後的細胞導致 ULBP2 從細胞膜遷移到細胞器組分，而各組分中其他蛋白質在 PRL-3 處理前後無明顯變化。

Example B. HIV Gag Protein Trafficking

Butluay et al Cell. （2014）， Spin Column-Based Fractionation.

Kutluay 等人[2]研究 HIV-1 病毒顆粒組裝過程中 Gag-RNA 複合體的分布及變化情況。實驗中關鍵步驟之一是證明在不同亞細胞結構中 Gag-RNA 複合體表現出不同形式。

用 HIV-1 病毒質粒轉染 4SU-fed 293T 細胞後，通過離心管柱法進行亞細胞結構分離，分離後的細胞漿和細胞膜組分進行 Western 印跡和免疫沉澱實驗。

結果表明，胞漿中的 Gag 蛋白主要是單體形式，而細胞質膜上的 Gag 蛋白是多聚體形式（圖 B）。這一結論很大程度上取決於細胞漿和細胞質膜組分的徹底分離（圖 A）。

Example C. Isolated Plasma Membrane Shows Clearer Signals

Kashiwagi Y. et al. PLOS one （2015） , Spin Column-Based Fractionation.

大部分質膜蛋白為低丰度表達，沒有經過分離和富集時很難檢測和定量。上圖數據[3]顯示質膜蛋白富集後對灌注後小鼠心臟樣品中 SGLT1 檢測效果的影響。與總膜部分相比，SGLT1 和質膜蛋白內參 Na+/K+ ATPase 信號在質膜蛋白組分中都有顯著的增強。

Example D. Distribution of Target Proteins

Georgiou D. K. et al. JBC （2015）， Spin-Column-Based Fractionation.

Georgiou 等人[4]研究鈣離子通道複合物 Cav1.1 調控脂肪酸轉運蛋白 CD36 分布和脂肪酸代謝。Cav1.1 E1014K 基因敲除小鼠（EK）和野生小鼠（WT）的肌肉組織樣品，通過離心管柱法進行亞細胞結構分離，分離後的細胞漿，細胞核，細胞膜以及純化的線粒體組分進行 Western 印跡檢測 CD36 的表達及分布情況。

Lamin A，GAPDH 及 VDAC 分別為細胞核，細胞漿及線粒體組分的內參。結果表明，與 WT 相比，EK 小鼠的 CD36 在細胞漿組分中增加，在質膜組分中減少。其它膜蛋白（eNOS,Cav1.1,RyR1）則無明顯變化。

Example E. Cell Fractionation and IP

Devarakonda et al. BMC Cancer （2015） 15:614, Spin-Column-Based Fractionation.

Devarakonda 等人[5]研究乳腺癌患者細胞 HSP90 蛋白與重鏈抗體（HCAb1 及 HCAb2）靶向結合。乳腺癌樣品通過離心管柱法進行亞細胞結構分離，分離後用細胞漿和細胞膜蛋白進行 IP 實驗。

結果表明只有 HCAb2 可在細胞漿中沉澱內源 HSP90 及重組蛋白（HSP90beta），HCAb2 也可在細胞質膜中沉澱內源 HSP90。

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亞細胞結構分離的常用方法有哪些？

1. 蔗糖密度超高速離心分離法

傳統方法進行亞細胞結構分離是通過蔗糖密度超高速離心分離[6,7]，操作方法十分繁瑣和耗時並且需要較大樣品量。 通常需要幾個小時甚至幾天才能完成。步驟複雜，需要特殊設備儀器，自配溶液，以及需要優良的操作技術。

2. 表面活性劑提取法

大部分商業試劑盒屬於這類方法。可將細胞分為兩大組分：胞漿蛋白和總膜蛋白，但無法單獨提取質膜蛋白組分，下游無法進行蛋白互作類研究。

3. 離心管柱法亞細胞結構分離法

你可能不知道，離心管柱法是新一代的亞細胞結構分離技術。離心管柱法亞細胞結構分離無需勻漿儀和超高速離心機，簡單而快速。

細胞/組織樣品首先通過一個特製的離心管柱，在這個過程中細胞膜會被破裂，完整的細胞核，細胞器，質膜和胞漿蛋白被釋放到溶液中，之後進一步分離成五個組分：細胞核，細胞漿，總膜，細胞器，質膜。

使用離心管柱和獨特的緩衝系統配合，可以獲得高回收率，低交叉污染的天然亞細胞結構蛋白，整個操作不到一小時即可完成。

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