「CRISPR-Cas9魔剪」失靈了？谷峰：三大操作問題或為脫靶「元兇」

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文/張楠

導語：近日，Nature Methods刊登一篇論文，來自哥倫比亞大學、斯坦福大學、艾奧瓦大學的研究人員通過WGS全基因組測序技術，檢測到使用CRISPR技術治療的小鼠產生上千個意外的基因突變，發生大量基因脫靶現象。該爆炸性文章立即引起業界高度關注和熱烈討論，也讓備受推崇的CRISPR技術陷入短暫的「滑鐵盧」。為此，貝殼社邀請了國家重點研發計劃和國家自然科學基金項目評審專家，國內最早進行基因組編輯研究的科學家之一谷峰博士作客線上沙龍，獨家解讀事件始末和真相緣由。

基因編輯技術發展歷程

基因編輯，最早起源於榮獲2007年諾貝爾生理醫學獎的基因打靶技術。美國猶他大學醫學院的馬里奧-R-卡佩奇(Mario R.Capecchiand)、英國卡迪夫大學醫學院的馬丁-J-伊文思(Martin J.Evans)和北卡羅萊納大學醫學院的奧利弗-史密西斯(Oliver Smithies)三位科學家的一系列重大研究突破，讓小鼠中的基因打靶技術得以問世。

小鼠基因打靶，是將一段外源序列插入小鼠胚胎幹細胞中，替換小鼠胚胎幹細胞的特定基因。由於該技術能實現基因定點改造，因而具有巨大應用潛力，對整個生命科學與醫療研究價值重大。但經典的基因打靶效率非常低，陽性概率是10-5~10-6，只有百萬分之一，讓學科發展受到嚴重阻礙。

後來發現新的基因編輯工具，鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)，是一種人工改造的核酸內切酶。鋅指結構存在於大部分的轉錄因子蛋白中，能特異結合到基因啟動子區，所以ZFN是鋅指蛋白與核酸內切酶Fok1的融合產物，能在各種複雜基因組的特定位置切割形成雙鏈切口。

該酶出現意義非凡，美國Sigma-Aldrich公司將ZFN技術商業化，推動了科研應用與發展。但由於ZFN仍有不少缺陷，比如結合DNA存在很強不確定性，5年後又誕生新一代基因編輯工具TALEN，它具有結構簡單，特異性更高、成本低廉的優點，很大程度上替代了ZFN。TALEN技術靈感起源於抗病水稻，發現植物細菌蛋白TAL的氨基酸序列與靶位點的核酸序列具有一一對應關係，由此構建出能靶向定位的重組核酸酶TALEN。

2013年初，最新一代的人工核酸內切酶橫空出世，它就是CRISPR/Cas9技術。當時美國兩個實驗室，MIT的華人科學家張峰和哈佛醫學院的George Church的研究團隊同時在Science上發文，證明CRISPR編輯能在真核細胞中發揮作用，由此奠定重要的應用研究基礎。

文章發表後引起業內轟動，CRISPR-Cas9結構更簡單，只需兩個組件，Cas9蛋白和sgRNA序列，打靶的sgRNA引導Cas9核酸酶在基因組（包括iPS基因組）的特定位點上進行切割與修飾。DNA雙鏈斷裂後，自身會修復，如果有意人為引入修復模板，就能糾正特定基因。

因為操作簡單，花費更少，CRISPR技術很快普及開來，在此基礎上，全球實驗室做了大量工作，分別從細胞系、動物水平以及iPS水平進行基因組的特定編輯，科研成果也相繼發表在Science，Nature biology和Cells等知名期刊上。

現在，CRISPR/Cas9技術已分別在患有杜氏肌營養不良、B型血友病和PRKAG2心臟綜合征的小鼠模型中成功發揮療效，並在感染的哺乳動物乙肝細胞中刪除了病毒DNA，這些實驗的成功表明「CRISPR魔剪」有望治療人類相關疾病。

實驗操作細節或致小鼠上千基因突變

至於近期報道的基因編輯引發上千突變的熱議文章，谷峰博士解釋，該實驗方法是為基因缺陷小鼠進行基因治療，將疾病小鼠的受精卵取出來，注射Cas9蛋白，sgRNA是以質粒形式注射進去，外加修復模板。修復後採用全基因組測序方法進行檢測，在兩個小鼠體內發現1736個單鹼基突變和1696個鹼基突變。

這樣操作有幾個問題，一是行業公認做法是將純化的Cas9和體外表達的sgRNA顯微注射至受精卵，得到轉基因動物模型，但該實驗是注射質粒形式的sgRNA，對此操作產生一點疑問；第二是注射受精卵後，因為受精卵會分裂很容易產生嵌合體，也容易產生錯誤結果。在遺傳病治療方面，一般很少用受精卵，受精卵僅用於科研，實際治療中幾乎無用。最後，靶點選擇問題，如果不使用經典的PAM（NGG），敲除效率也會降低，而且注射劑量，如酶的過量使用都會造成脫靶。所以對於引發上千個基因突變的實驗結果，研究人員應該認真分析實驗設計與操作。

谷峰博士認為，降低脫靶率的策略還有尋找長序列PAM，提高保真力，選擇高保真的Cas9並採用雙缺口酶策略是目前解決脫靶的最好方案。

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