藥物設計中的鄰位修飾策略

神說，要有光，就有了光。人說，要有葯，就有了……無數失敗的臨床試驗。新葯研發湍流激蕩，縱以黃金與光陰打造行船，仍不免折戟沉沙悲白髮。新葯研發的歷史，是人類不斷學習如何HACK自然的歷史。大自然依賴億萬年的經驗才用原子創造了日月星辰，山河湖海，飛鳥走獸，男人女人；而藥物設計，則是人類期望憑藉1.4kg的大腦，用原子搭建出葫蘆中的丹藥，以濟世人。悠悠的歷史長河中，從JamesBlack首次理性藥物設計出H2受體拮抗劑西咪替丁，到BruceRoth設計出比天然產物的他汀們更好的阿托伐他汀；從Max Perutz手動搭建血紅蛋白2×10^8:1的真實模型，到Martin Karplus 和「Tack」 Kuntz把計算引入生物學；從Jack Baldwin基於碳酸酐酶蛋白結構設計出抑制劑多佐胺，到計算機輔助藥物設計（CADD）廣泛運用於各大製藥公司和科研院所，藥物設計不僅融合了科學與藝術，而且依賴於實踐與經驗，靈光一現卻也浸透汗水。現代藥物設計的策略、方法和工具越來越豐富多樣。那暫且從滄海之中撈出一粟，讓我們來聊一聊藥物設計中的鄰位修飾策略以及如何運用CADD的方法來指導鄰位修飾吧。

1. 鄰位修飾策略對活性的影響

在藥物設計優化小分子與蛋白質的相互作用時，常常會在苯環上進行修飾或取代。苯環上的取代，有鄰位，間位和對位之分。間位和對位的取代或修飾，常常影響的是小分子與蛋白質的直接相互作用。而鄰位的修飾或取代，不僅會影響小分子與蛋白質的直接相互作用，而且會影響小分子本身的構象。小分子本身的構象重不重要呢？我們知道，小分子本身具有一定的柔性，在未結合蛋白之前，在溶液中存在多種不同的構象，其中可以與蛋白結合的構象有助於活性，而不能與蛋白結合的構象則對活性不利。我們可以算一個簡單的帳。根據?G=-RTLnK進行換算，可以知道，當小分子在溶液中的最低能量構象與小分子在結合位點的活性構象的構象能量差別是1.4 kcal/mol時，親和力會有10倍的差別，而當相差2 kcal/mol時，親和力會有30倍的差異！所以，在藥物設計的過程中，借力於CADD技術，把小分子在溶液中的最低能量構象調節到與結合位點的活性構象相似，成為一個可以為之努力的方向。當然，還是要眼見為實。下面就看看這樣幾個例子吧。

巨擘Jorgensen曾研究過p38α MAP激酶抑制劑的「Magic Methyl」，當R基團為H原子時，活性大於2.5μM，而當R基團為甲基時，活性顯著提高到12nM（下圖左上）。觀察該化合物與p38α MAP激酶的結合模式（下圖右側），可以發現，只有當兩個苯環的二面角在90度左右，才能和蛋白有較好的結合，否則會與蛋白有嚴重的空間碰撞。通過CADD技術中的蒙特卡洛模擬，計算出小分子兩個苯環的二面角的分布（下圖左下），可以明顯看出，如果R基團為H原子的話，該化合物本身未結合蛋白之前的低能量構象（藍色曲線）是兩個苯環的二面角在140度左右，遠遠偏離了在結合位點的活性構象（綠色曲線）。而當R基團為甲基時，該化合物本身未結合蛋白之前的低能量構象（橙色曲線）是兩個苯環的二面角在70度左右，與在結合位點的活性構象（紅色曲線）較為接近。所以，該甲基除了通過與蛋白形成疏水相互作用增加活性外，更為重要的是通過影響兩個苯環的二面角的傾向性，顯著地提高了生物學活性。因為僅依靠單個甲基的疏水相互作用，是很難提高200多倍的親和力。

接下來，我們再來看一個複雜一點的例子。這是一篇Amgen研發Cdc7激酶抑制劑的文章。文章中，他們公布了化合物的結構（下圖左下）以及活性數據（下圖右下）。初略一看，譬如化合物9和化合物2，僅僅相差一個-CN基團，活性便提高了60倍，相信很多人都會很好奇。但是因為某些原因，Amgen並沒有公布或者得到這些化合物與Cdc7激酶的結合模式，也沒有給出該活性變化的解釋，這就給我們理解構效關係和設計新化合物帶來了一定的障礙。這個時候，CADD就應該出馬了。於是筆者通過計算快速模擬了活性最好的化合物37與Cdc7激酶的結合模式（下圖右上），可以看出，-CN基團與蛋白口袋深處的殘基形成了相互作用。當然，這個結合模式並不是簡單地把化合物對接到蛋白結合位點，挑出打分最高的就能得到，而是需要綜合考慮構效關係等各種因素，挑選出最合理的結合模式，譬如與激酶鉸鏈區形成氫鍵的氨基嘧啶環，在對接結果中，就會出現翻轉180度與激酶鉸鏈區另外一個羰基形成氫鍵的模式，這都是需要考慮的問題，不過在這裡就不細說了。基於這個計算出的結合模式可以預測，化合物兩個環之間的二面角接近0度才能與蛋白形成較好的相互作用，而角度較大時則會降低活性。所以，這個計算出的結合模式就可以指導我們下一步的分子設計，而不再是漫無目地修飾。根據我們上一個例子學到的知識，我們來看看，是否可以通過量子化學計算得到這些化合物不同二面角的能量分布，並結合之前得到的結合模式，從而預測化合物活性的變化，設計出更好的化合物呢？化合物5與化合物2活性相差120倍，從二面角能量分布圖可以看出（下圖左下），化合物2二面角的低能量構象（藍色曲線）是0度左右，與結合模式中的活性構象非常接近，而化合物5二面角的低能量構象（紫色曲線）是40度左右，與結合模式中的活性構象能量差異接近4kcal/mol，因此造成了活性的損失。而化合物18低能量構象（綠色曲線）處於180度，在0度的能量差異有接近8kcal/mol，基本上處於沒有活性的狀態，即使有-CN基團，也會偏離結合模式中的位置。那麼基於這些分子對接的結果，以及量子化學的計算和分析，活性最高的化合物37是如何設計出來的呢? 聰明的讀者可以試著想一想。

2. 鄰位修飾策略對PK的影響

從上面兩個例子可以看出，鄰位的修飾對生物活性的影響是顯著的。然而藥物研發不僅僅只有活性，還有重要的葯代動力學性質，也就是我們常說的吸收、分布、代謝和消除。以口服藥物為例，當你吞下一片藥片，它就開始了自己的神奇之旅，胃腸道的溶解和吸收，肝臟的代謝，組織的分布，靶點的結合，最後離開身體，回歸大自然。這一系列的過程極為複雜，各種各樣的酶，受體和轉運體等都參與其中，在有限的時間內，我們很難精細地去探究每一個步驟。所以我們採用一些可測量或可計算的參數，來描述這樣一個複雜過程。鄰位修飾策略可以通過影響小分子的構象來影響小分子的葯代動力學。下面我們來看一個例子。

業餘愛好是寫書的Jack Li還在輝瑞工作的時候，其中一個研發項目是開發通過選擇性作用於基質金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13）的口服小分子抑制劑來治療骨關節炎（Osteoarthritis）。我們來看看其中兩個代表性的化合物的葯代動力學性質。可以看到，左邊的化合物生物利用度低，清除率高。作者研究發現，左邊的化合物的喹唑啉酮里的苯環在體內會被氧化，所以為了阻礙這種氧化，把苯環換成了吡啶，的確問題得到了解決。但是看到這裡，我們應該問一個問題，苯環換成了吡啶，是不是真的只是阻止了氧化？設計思路是怎麼樣的？其實看了數據，就很比較明確，從左邊的化合物到右邊的化合物，清除率（CL）雖然有一定程度的改善，但是生物利用度（%F）更加顯著地上升。而我們知道，裸露的伯醯胺（Primary Amide）對於化合物透過細胞膜是非常不利的，這很有可能是導致左邊的化合物生物利用度差的原因之一。當在醯胺的鄰位把C修飾為N，醯胺與N形成內氫鍵，掩蓋了裸露的NH，就有可能提高透膜性。當然，還有一個原因是，醯胺與N形成內氫鍵後，小分子的構象分布也發生了變化，讀者可以推敲一下。只是可惜作者並沒有給出透膜性相關的數據。總的而言，通過仔細分析文中數據，是不是看到了隱藏在作者心中但並未在文章中出現的藥物設計小技巧呢？

3. 三維空間的鄰位修飾策略

從上面的例子可以看出，鄰位修飾策略，在提高活性和改善葯代動力學性質都有一定的應用，其中CADD的計算和預測功不可沒。不過這些鄰位，都是容易在化合物的二維結構中就能看到的鄰位。如果化合物的兩個位點在二維結構中相隔較遠，誤認為它們之間不太可能相互影響，但是實際上，它們是否通過空間摺疊，在三維空間中變得臨近呢？下面我們來看一個有趣的例子。

今年ASCO會議上，Loxo Oncology公司的NTRK小分子抑制劑Larotrectinib，對NTRK融合突變的多種癌症都有效果，著實火了一把。那麼這個分子結構如何，又是如何和TRK激酶相互作用的呢？前段時間看到Larotrectinib的新聞後，筆者頗有興緻地快速模擬了該化合物與TRKA激酶的結合模式（下圖上，未進行徹底地文獻搜索，不知是否已有該結合模式發表，待考證）。可以看到，Larotrectinib通過吡唑並[1,5-a]嘧啶與TRKA激酶的鉸鏈區形成一根氫鍵，對二氟苯則與蛋白形成疏水相互作用，而吡咯環上的OH則與蛋白形成兩根氫鍵。從三維結構中是否看到，原本在二維結構中相距甚遠的對二氟苯和吡咯環，在三維空間上其實是鄰居呢？這種相互靠近的方式，應該如何進行修飾和改造呢？輝瑞公司基於Crizotinib改造出來的Lorlatinib，已經給出了其中的一個答案。那麼讀者可以想想，還有什麼其他可以做的呢？再看看Entrectinib，是不是又有了更多的想法呢？

通過上面這些例子，大家是否對藥物設計中的鄰位修飾策略有了一定的了解呢？這概念本身很簡單，鄰位C/N的互換，鄰位-CH3/-F/-Cl的增減，猶如金庸小說中的降龍十八掌，招式平凡無奇，但效果驚艷，因為許多繁複的變化已然蘊含其中，而CADD正是了解這繁複變化的有力工具之一。看了這篇文章，對以前研究項目中無法解釋的數據，或將來如何設計化合物，是否有了一些新的思路和看法呢？

如前所述，鄰位修飾策略，不過是藥物設計中的滄海一粟。還有許多或簡單粗暴或精妙絕倫的方法和技巧，限於篇幅，無法一一提及。CADD在藥物發現與設計中的應用，也還有更多波瀾壯闊的故事。寫到興起處，自娛自樂地Encore一段，再說一小段CADD的故事。2015年，BrianShoichet夥同Bryan Roth等人，在Nature雜誌發表了一篇發現孤兒GPCR受體GPR68的小分子正向變構調節劑的文章。大神Bryan L. Roth，相信了解GPCR的朋友一定不會陌生。而大神Brian Shoichet，如果你曾經在體外篩選化合物時添加去垢劑（Detergent）來避免小分子聚合造成的假陽性，那麼你應該感謝下Shoichet。然而，這項工作不過是曾修讀歷史本科學位的Shoichet在他之後的研究工作中的業餘興趣愛好而已，因為他正式的身份是DOCK一門的傳人。前些日子朋友圈花式刷屏的文章，通過虛擬篩選發現不同於嗎啡結構的μ受體偏向性激動劑PZM21的工作，也是Shoichet組的貢獻之一。言歸正傳，我們來聊聊GPR68這篇文章。人體有120多個非嗅覺的GPCR受體被歸類為孤兒受體，因為我們不清楚它們內源的配體是什麼，這給我們了解這些重要受體的生物學功能造成了困難。其中GPR68在多種組織都有表達，尤其在小腦和海馬中富集，暗示其重要的生物學功能。那麼，找到一個選擇性高的小分子正向變構調節劑，對於我們研究該GPCR受體的功能是非常有意義的，這也是新葯研發的源頭，新靶點的發現與驗證，也是First-in-Class藥物的必經之路。插說一句，我們常常說現在國內還不具備做First-in-Class藥物的環境與條件，然而，哪個First-in-Class的葯是在環境和條件都已經準備好了的情況下研發出來的呢？世之奇偉、瑰怪、非常之觀,常在於險遠,而人之所罕至焉。回歸正題。作者先是通過改良的酵母系統，篩選出了勞拉西泮，一個作用於GABA受體的藥物，能夠以正向變構調節劑的方式激活GPR68。但是既然還能作用於GABA受體，那怎麼研究GPR68單獨的激活呢？當然是提高選擇性和活性。不過作者遺憾地說「…little improvement in activity or selectivity was achieved bytesting lorazepam analogues…」，雖然這句話一帶而過，可是充滿碩博後們的血淚啊。如果研究就此打住，那這個故事也就飛快地被人們遺忘。不過這個時候，Brian Shoichet說，不如讓我們來試試？試試就試試。

擺在他們面前的第一個嚴峻的問題就是勞拉西泮在GPR68上的結合位點在哪？尤其這還是一個別構位點。不過，Brian Shoichet總歸是Brian Shoichet，一套CADD的組合拳打得出神入化。首先，基於序列相似性，以CXCR4的晶體結構為模板，搭建GPR68的多個同源模型（a），同時搜索蛋白的主鏈以及Loop的構象，因為蛋白質柔性是影響分子識別的重要因素，總共生成了3307個GPR68的不同構象的同源模型(b)。然後根據其他GPCR受體的配體或多肽結合位點，猜測並挑選了GPR68上5個可能的別構位點。然後把勞拉西泮以及多個已知無GPR68活性的化合物都通過分子對接軟體DOCK對接到這3307個同源模型的5個可能的別構位點中(c)（有沒有看到CPU在熱呼呼地轉？）。在分子對接模型中對勞拉西泮以及多個已知無GPR68活性的化合物進行打分評估，理想情況是勞拉西泮排名靠前，則說明該同源模型的結合位點能夠區分陽性和陰性化合物，可能是真實的結合位點。得到勞拉西泮與GPR68結合較好的多個複合物模型後，繼續優化結合位點(d)，並再次將勞拉西泮以及多個已知無GPR68活性的化合物對接到優化後的結合位點。如此迭代，直到得到一個勞拉西泮與GPR68穩定的結合模式（f），並且在打分系統中排名第一，同時，這個結合模式中的相互作用方式和重要殘基，也要滿足之前觀察到的現象（即某種方式的SAR），並且能夠經得起後續的殘基突變實驗的驗證。最終確定這個結合模式後，我們就初步確定了勞拉西泮與GPR68可能的結合位點和方式。然後，為了尋找活性更強選擇性更好的化合物，把300萬個小分子對接到這個可能的結合位點，並打分排序，最終挑選了17個化合物進行活性測試，得到了幾個不錯的hit（g），然後進一步優化（h），最終發現Ogerin這個化合物，可以選擇性作用於GPR68，並且在GPR68敲除的小鼠中沒有效果，探究了GPR68在記憶恢復中的生物學功能。在這個例子里，從對化合物如何與蛋白結合一無所知，到最後發現選擇性的別構位點調節劑，是不是覺得CADD在其中還是發揮了相當重要的作用？Brian Shoichet的這一套組合拳打下來，讀者是不是已經有一點暈頭轉向？計算量還是不小的。不過即使在看重時效的工業界，筆者的自身體驗是，這套組合拳的簡約版，也能耍得有模有樣，虎虎生風，在藥物研發中起到重要作用。

展望開來，前有Vertex和 Vitae 等CADD驅動的老牌勁旅，後有Nimbus和Relay等新貴崛起，計算機在新葯研發中的作用，正前所未有地蓬勃發展。時至今日，小分子新葯研發依然天地廣闊，應與大分子新葯研發齊頭並進，爭論孰優孰劣並無意義。譬如說，小分子雖然常常被詬病選擇性差，不過從另外一個角度來想，如果選擇性真的無可挑剔，那本來靶向C-Met激酶的Crizotinib還能救ALK陽性的患者於水火嗎？新葯研發充滿未知，路途艱險，夜深人靜之時，細細思量，失去時得到了什麼，得到時又失去了什麼。

與君共勉。

參考文獻

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Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 23 (2013) 2056–2060

J. Med. Chem. 2008, 51, 835–841

http://www.ascopost.com/News/55705

Nature. 2015;527(7579):477-83

Nature. 2016;537(7619):185-190

J. Comput. Chem. 1992; 13:380–397

J. Med. Chem. 2003, 46, 4477-86

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