MAPK與NSCLC幹細胞

Oncotarget. 2017 Apr 18; 8(16): 26702–26717.

Published online 2017 Mar 1. doi:10.18632/oncotarget.15804

Inactivation of p38 MAPKcontributes to stem cell-like properties of non-small cell lung cancer

標題：滅活p38 MAPK有助於NSCLC幹細胞樣屬性

摘要：癌症幹細胞(CSCs)被公認為癌症起始和複發的主要根源。然而，在癌細胞中癌症幹細胞屬性的獲得和維持的機理尚不清楚。在目前的研究中，與正常組織相比，在肺癌組織中我們觀察到活化p38 MAPK的水平被下調，而幹細胞標誌物sox2的水平被上調。我們進一步證明，p38的滅活是一種潛在的機制，有助於非小細胞肺癌(NSCLC)細胞癌症幹細胞屬性獲取和維護。p38,尤其是p38γ和p38δ同類型,抑制癌症幹細胞屬性和非小細胞肺癌細胞的腫瘤啟動能力具備幹細胞，促進幹細胞蛋白如SOX2 Oct4,Nanog,Klf4和c-Myc的泛素化和下調,通過MK2介導的Hsp27磷酸化，而Hsp27是蛋白酶體降解機制一個重要的組成部分。與此相反，在肺癌細胞中p38的滅活會導致幹細胞的形成，從而促進這些細胞的癌症幹細胞屬性。這些發現證明了一種新的機制，即癌細胞癌症幹細胞屬性的獲得和維持，並揭示了p38途徑在抑制癌症發展方面的新功能。這些研究也發現了一種新的途徑，可以作為癌症治療的靶點，以消滅CSCs。

引言：

肺癌是世界上癌症死亡的主要原因之一。肺癌可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(NSCLC)。超過85%的肺癌是NSCLC，它的存活率較低。因此，研究肺癌的發展機制，尤其是NSCLC的發展機制，是非常有意義的。

癌症幹細胞(CSCs)是一小群癌細胞，它們具有自我更新、分化和在體內腫瘤初始能力。CSCs是引起癌症初始，複發和耐葯的主要原因，在癌症發展中起著重要的作用。Oct4(Octamer-bindingtranscription factor 4/八倍結合轉錄因子4)、SOX2(SRY(sex determining region Y/性別決定區域Y)-box 2)、Nanog、Klf4(Kruppel-like factor 4/Kruppel樣因子4)和c-myc的過表達，可以誘導體細胞獲得多能性。這些蛋白質也作為CSCs的標記。特別地，SOX2與Oct4相互作用，以維持胚胎幹細胞(ESCs)的多能性。SOX2不僅在調節多能性方面發揮了重要作用，而且在調節自我更新和分化方面也發揮了重要作用。在幾種類型的癌症中，如肺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，SOX2的表達增加。然而，SOX2和其他CSC標記在癌症中過度表達的機制還是未知的。

目前還不清楚CSCs是如何獲得的，以及如何在癌細胞中保持幹細胞的狀態。p38 MAPK(mitogen-activatedprotein kinase/有絲分裂蛋白激酶)信號通路最初被確認為炎症和應激反應的媒介，但後來被證明在不同的生理或病理條件下發揮重要作用，包括癌症發展。p38在癌症發展中的作用似乎與環境有關。雖然一些研究報告說p38通過介導腫瘤細胞的入侵和轉移來促進腫瘤的發生，但另一些研究表明p38通路通過抑制細胞增殖和調節腫瘤基因誘導的衰老來起到抑制腫瘤的作用。然而，對於p38的腫瘤抑制活性的具體機制還沒有完全了解。p38和CSCs之間的聯繫並沒有得到很好的研究。

在哺乳動物中，已經發現了四種p38 MAPK，分別是MAPK14 (p38α), MAPK11 (p38β), MAPK12 (p38γ)和MAPK13 (p38δ)，它們被分為兩個子組: p38α和p38β，p38γ和p38δ。MKK6可以磷酸化所有p38 MAPK家族成員，而MKK3則主要激活p38α, p38γ和p38δ。p38α是最佳的同形體，但近年來，p38γ和p38δ在癌症中作用已得到越來越多的關注。例如，有報道說p38γ和p38δ抑制細胞遷移，p38δ介導接觸抑制，p38δ抑制細胞增殖。此外，p38γ和p38δ對於癌基因誘導衰老是至關重要的，這是一種抑制腫瘤的機制。這些發現表明p38γ和p38δ具有腫瘤抑制功能。與此觀點一致的是，目前的研究表明p38γ和p38δ抑制了幹細胞在肺癌細胞中的表達，從而抑制了幹細胞的生長。

熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是一種蛋白質家族，它扮演分子伴侶的作用，包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40和hsp27。據報道，Hsp27可以促進受損蛋白質的再摺疊。越來越多的報告顯示，Hsp27在癌症中扮演著重要的角色，在不同情況下，扮演腫瘤促進者或腫瘤抑制者的角色。例如，抑制Hsp27加速TGF-β1介導的肺癌細胞EMT，這表明Hsp27抑制了癌症的發展。另一方面，Hsp27的表達與直腸腫瘤患者較差的生存以及非乾淨的手術切除有明顯的相關性。除了分子伴侶的作用外，Hsp27還被報道參與了一種蛋白酶的複合物，以促進在壓力條件下，多種蛋白質的泛素化和蛋白酶降解。此外，Hsp27是得到確認的p38下游效應子。一旦被p38激活後，p38下游蛋白激酶MK2和PRAK磷酸化Hsp27的Ser15、Ser78和Ser82位點，從而調節Hsp27的活性。

在本研究中，我們探討了p38通路在調節肺癌細胞的幹細胞屬性方面的作用。我們觀察到，與正常組織相比，在肺癌組織中，活性p38的水平被降低，幹細胞標誌物SOX2被上調。進一步的研究表明p38，特別是p38γ和p38δ同型體，通過MK2依賴Hsp27磷酸化促進泛素化和降解干蛋白，抑制NSCLC細胞的癌症幹細胞屬性，這是蛋白酶降解機制的一個重要組成部分。這些發現證明了一種新的機制，即癌症幹細胞屬性在癌細胞中獲得和維持，並揭示了p38途徑在抑制癌症發展方面的新功能。這些研究也發現了一種新的途徑，可以作為癌症治療的靶點，以消滅CSCs。

結果：

肺癌中活性p38的水平被下調，而SOX2水平被上調

先前的研究表明，p38或p38的下游信號傳導成分的滅活會促進小鼠模型的癌症發展，這意味著p38通路腫瘤的抑制作用。為調查激活p38 (p-p38)在人類癌症發展中的作用,我們分析了磷酸化和激活p38水平在人類肺腫瘤樣本，使用一個組織陣列包含153完整NSCLC腫瘤組織(79個鱗狀細胞癌和74個腺癌)和31個完整正常的肺組織/正常鄰近腫瘤肺組織(NAT)(18正常肺組織和13 NAT)。我們觀察到，與正常組織相比，p-p38的水平在肺癌組織中明顯降低，與在人類癌症中激活p38的腫瘤抑制功能相一致。有趣的是，在腫瘤組織中，幹細胞標誌物SOX2的表達水平與正常組織相比，被上調。我們還執行了Spearman的排名相關測試，發現了SOX2水平和p-p38水平之間的微弱的負相關，p值為0.128。這些觀察結果表明，活性p38可能抑制諸如SOX2這樣的幹細胞的表達，而在肺癌細胞中p38的滅活會增加SOX2的表達，從而促進獲得癌症幹細胞樣的屬性。

p38信號通路會下調非小細胞肺癌細胞幹細胞標記物的表達和幹細胞樣屬性

探討p38的角色對肺癌細胞干屬性作用,我們比較了p38(p-p38)和SOX2的激活和磷酸化水平在3非小細胞肺癌細胞系,A549,H460 H1299。實際上，p38活性與SOX2的表達水平之間存在負相關。在這3個細胞系中，A549個細胞的p-p38的水平最低但SOX2的水平最高，而H1299細胞則是p-p38的水平最高，但是SOX2的水平最低。H460細胞顯示p-p38和SOX2的中間水平。這些觀察結果表明，p38可能會降低SOX2的表達。

我們進一步研究了p38的結構激活或顯性無突變抑制肺癌細胞SOX2和其他幹細胞標誌物的表達。MKK3和MKK6是p38的上游激活激酶。我們採用過表達結構活化的MKK3(MKK3E)和MKK6(MKK6E)突變在p-p38水平最低A549細胞,顯性無突變MKK3(MKK3A)和MKK6(MKK6A)在p-p38水平最高H1299細胞,並結構活化的或顯性無突變MKK3和MKK6在p-p38中間水平H460細胞。結果表明，當p38被MKK3E和MKK6E結構性激活後(以p-p38水平增加所示)，在A549和H460細胞中，包括SOX2、Oct4、Nanog、Klf4和c-myc在內的幹細胞的表達水平下降了。相反，當p38活性被顯性無突變MKK3A和MKK6A (以p-p38水平下降所示)所抑制時，這些幹細胞的表達水平在H1299和H460細胞中增加。H1299-MKK3A細胞繫結構性無表達可檢測MKK3A水平,原因未知,因此,這個細胞系被排除在進一步的研究之外。

我們接著分析了p38激活和抑制對肺癌細胞的幹細胞屬性的影響，包括側群細胞的百分比和形成球體的能力。一個側群細胞表現出更高的DNA結合染料Hoechst 33342流出物，首次報道了在鼠骨髓中富含造血幹細胞(HSCs)。在某種程度上，具有高側群細胞特徵的腫瘤細胞具有癌幹細胞特徵。我們發現，由MKK3E或MKK6E激活的p38結構激活降低了A549和H460細胞中側群細胞的比例，與之相比，與向量控制(BP)的細胞轉換相比。相比之下，通過MKK3A或MKK6A在H460和H1299細胞中抑制p38，與矢量控制(BH)相比，側群細胞所佔的比例增加了。與這些觀察結果一致,球體形成試驗,MKK3E MKK6E減少A549和H460細胞形成的球體尺寸,而MKK3A和MKK6A增加H460和H1299細胞形成球體的能力,與矢量控制相比。這些結果表明，活化p38抑制了NSCLC細胞的幹細胞屬性，而p38的滅活會導致癌症幹細胞的擴展。

p38γ和p38δ抑制了NSCLC細胞的乾性

上面所述的觀察結果表明p38 MAPK抑制了NSCLC細胞的乾性。哺乳動物已確認了4個p38 MAPK同型體p38α, p38β, p38γ, p38δ.這些p38MAPK同型體根據序列同源性和對化學抑制劑的敏感性分為兩個子組，其中一個子組包括p38α和p38β,另一組包括p38γ和p38δ。這四種同型體在腫瘤發展的過程中分別扮演著不同的角色。為確定哪些同型體可能在非小細胞肺癌細胞調節幹細胞中發揮作用,我們採用2倍的策略,通過穩定表達野生型或者結構激活突變每個p38同型體在A549和H460細胞,或通過敲除每個p38同種型使用特定同型體shRNA在H460和H1299細胞,隨後檢測幹細胞標記物的表達水平,側群細胞百分比和細胞形成球體的能力。

西方的印跡分析證實p38同型體在適當的細胞系中要麼被過度表達，要麼被shRNA敲除，而p38同型體結構性活化突變顯示，與它們的野生型同類和向量控制相比，p38的活化突變顯示出增加自磷酸化水平。結構性活化p38γ和p38δ表達,有時是這2個野生同型體型抑制了SOX2,Oct4,Nanog,Klf4和c-Myc表達在A549和H460細胞,而無論是野生型形式還是活化突變p38α和p38β不能抑制這些幹細胞標記表達。此外，敲除p38γ和p38δ，而不是p38α和p38β,增加了SOX2、Oct4、Nanog、Klf4和c-myc在H460和H1299細胞中的表達。此外,與p38γ和p38δ調節幹細胞標記的表達能力相一致,野生型異常表達或者結構活化突變p38γ和p38δ減少側群細胞比例在A549和H460細胞,而shRNA介導敲除p38γ和p38δ增加側群細胞比例在H460和H1299細胞。相比之下,異常表達野生型和結構活化突變p38α或p38β，以及敲除p38α和p38β,沒有影響側群細胞比例在這些肺癌細胞。這些結果表明,p38γ和p38δ是主要p38同型體，抑制非小細胞肺癌細胞的幹細胞屬性。

結構活化突變p38γ和p38δ在體內降低A549腫瘤初始能力

癌症幹細胞被認為是腫瘤的初始細胞。激活p38抑制腫瘤幹細胞，促使我們研究p38對腫瘤初始化能力的影響。我們注入了不同數量的參照A549細胞(A549-bp)或表達結構活化突變p38γ(A549-p38γD179A)或p38δ (A549-p38δF324S)或p38δ(A549-p38δF324S)A549細胞，，並對腫瘤的初始和生長進行了監測。結果表明,在體內腫瘤形成所需的最少的細胞：A549-BP細胞1 × 105，A549-p38γD179A和A549-p38δF324S細胞5 × 105，與A549-BP腫瘤相比，A549-p38γD179A和A549-p38δF324S細胞增長速度降低。結果表明，結構活化突變p38γ和p38δ能降低體內腫瘤的初始化能力。

p38γ和p38δ減少了幹細胞的蛋白質穩定性

p38在調節肺癌細胞的幹細胞方面的作用，促使我們研究了p38抑制幹細胞的表達的機制。我們首先研究了p38激活和抑制對幹細胞的mRNA水平的影響。我們發現MKK3E和MKK6E未能持續抑制SOX2 Oct4,Nanog,Klf4和m-Myc的mRNA水平,在A549和H460細胞,MKK3A和MKK6A沒有持續增加幹細胞基因的mRNA水平在H460和H1299細胞,這表明p38調節這些幹細胞基因並不發生在轉錄和轉錄後。我們觀察到一些適度的(≤2倍)的，還是有意義的p38活化或滅活的細胞中幹細胞蛋白mRNA水平差異，與參照細胞相比。然而，這些差異在不同的肺癌細胞，或不同的干蛋白，在不同的p38激活子(MKK3E和MKK6E)或抑制子(MKK3A和MKK6A)之間是不一致的，大多數變化都沒有反映在蛋白質水平上。因此，我們認為這些微小的差異在mRNA水平上是微不足道的。

接下來，我們研究了p38是否能調節幹細胞的蛋白質穩定性。為了探索這種可能性，我們測量一種翻譯抑制劑環己醯亞胺治療後的、1、2、6、9和15個小時內的NSCLC蛋白質降解速率。結果表明, SOX2,Oct4,Nanog,Klf4和c-Myc蛋白質的穩定性降低在MKK3E結構活化p38在A549細胞時,併當p38被MKK3A抑制在H460細胞和MKK6A抑制在H1299細胞這些蛋白的穩定性增加。作為一種負控制，p38的狀態對ERK蛋白的穩定性沒有影響。這些觀察結果表明p38 MAPK的激活降低了幹細胞的蛋白質穩定性。

使用相似的方法，我們下一步調查SOX2、Oct4、Nanog、Klf4和c-myc的蛋白質穩定性是否受到p38γ和p38δ的調控。我們在H460細胞中檢測這些蛋白質的半衰期，這些細胞表達野生或活性突變p38γ或p38δ，或p38同型體shRNAs。我們發現的活化突變p38γ和p38δ,和在某些情況下, p38同型體野生型,減少SOX2,Oct4,Nanog,Klf4和c-Myc蛋白質的穩定性;相反,敲除p38γ和p38δ增加了這些幹細胞標記蛋白質的穩定性。這些結果表明，p38γ和p38δ抑制了NSCLC細胞的乾性，降低調節幹細胞的基因的蛋白質穩定性。

值得注意的是,除了結構活化形式的p38γ和p38δ外,野生型p38γp38δ也減少了側群細胞的比例和降低某些幹細胞基因表達水平和蛋白質穩定性,儘管在大多數情況下程度比結構活化形式的p38γ和p38δ低。我們推論，野生型p38同型體的過度表達，也可能導致細胞中p38活性的增加，儘管它們不攜帶有活性的突變，但p38蛋白濃度的增加。實際上，在A549和H460細胞中表達野生的p38γ和p38δ，p38自磷酸化水平明顯增加，與向量控制的轉導細胞相比。此外，我們還測量了在H460細胞中使用免疫沉澱蛋白激酶分析，異常表達於H460細胞野生和結構活化突變的p38γ和p38δ蛋白激酶活性。我們發現野生型p38γ和p38δ顯示明顯的趨向ATF2基質蛋白激酶活性,儘管活性沒有高達這些結構活化突變同型體。這些觀測結果表明,p38γ和p38δ抑制非小細胞肺癌細胞幹細胞能力取決於這些蛋白激酶活性。

p38促進了泛素化和蛋白酶介導降解

p38降低幹細胞基因的蛋白質穩定性，增加了一種可能性，即p38可能通過蛋白酶來調節這些蛋白質的泛素性降解。為了研究這種可能性，我們研究了p38激活對在A549和H1299細胞中一種幹細胞SOX2的泛素化和降解作用的影響，，通過A549和H1299細胞中穩定地轉導的一個帶有ha標記的SOX2，隨後分別進行MKK3E和MKK6A轉導。西方印跡分析顯示，ha-sox2在這些細胞中表達無誤。與內生SOX2一起, HA-SOX2的蛋白質水平在A549細胞被MKK3E降低,在H1299細胞被MKK6A增加;然而,MKK3E的影響和MKK6A基本上被MG132（一種蛋白酶體抑制劑）治療所消滅, ,如免疫印跡分析所示，表明SOX2確實是由p38激活的蛋白酶所降解。此外，我們使用抗體抗HA進行免疫沉澱HA-SOX2反應，並檢測HA-SOX2泛素。結果表明，在MG132治療的存在和缺失的情況下，在A549個細胞中，SOX2的泛素化被MKK3E增強，而在H1299細胞中，SOX2被MKK6A降低。基於這些觀察結果，我們得出結論:激活的p38通過促進泛素化和蛋白酶介導降解，降低了SOX2的蛋白質穩定性。

p38調節非小細胞癌的幹細胞通過磷酸化Hsp27的Ser78和Ser82位點

Hsp27是一種p38調節的小熱休克蛋白，它促進了蛋白泛素化和蛋白酶介導的蛋白質降解。通過p38下游基質激酶MK2和PRAK，激活的p38誘導Hsp27在Ser15、Ser78和Ser82位點的磷酸化。為了應對壓力，Hsp27與它的蛋白質靶點結合，如I-κBa、p27Kip1和AUF1，並促進它們的泛素化和蛋白酶介導降解。Hsp27這個功能似乎取決於p38介導的磷酸化，由於已知壓力激活p38通路和Hsp27的Ser15, Ser78和Ser82磷酸化突變，極大地促進了Hsp27的結合能力,促進靶蛋白的蛋白酶體降解。另外，Hsp27似乎可以調節多種蛋白質的蛋白酶降解，因為Hsp27壓力條件下的異常表達降低了泛素化蛋白質的整體水平。

這些觀察結果促使我們去調查Hsp27在NSCLC細胞是否能應答於激活p38而調節幹細胞蛋白的蛋白酶降解進行研究。我們發現，在A549細胞中，低水平活化的p38細胞，Hsp27在Ser15、Ser78和Ser82上的磷酸化，是由MKK3、MKK6、p38γ和p38δ的異常表達結構活化形式所刺激，而非野生型p38γ和p38δ。相反的，在H1299細胞中，高水平活化的p38，表達顯性無突變形式MKK6(MKK6A)或p38γ或p38δ基本上廢除了Hsp27三個位點上的磷酸化。兩個p38的下游基質激酶MK2和PRAK一旦被p38激活可以直接在Ser15、Ser78和Ser82上對Hsp27進行磷酸化。為了確定MK2和PRAK在肺癌細胞中的Hsp27磷酸化過程中的作用，我們在A549細胞中用shRNA敲除MK2和PRAK。我們發現，MK2 shRNA，但不是PRAK shRNA，極大地減少了Hsp27 Ser78和Ser82位點由活化的p38γD179A和p38δF324S所引起的磷酸化，並沒有明顯影響Ser15的磷酸化。這些發現表明，活性p38γ和p38δ誘導hsp27 ser78和-Ser82位點的磷酸化通過NSCLC細胞中MK2。

為了研究p38誘導的Hsp27磷酸化在癌細胞幹細胞中的作用，我們構建了Hsp27突變蛋白，其中包含了磷酸基(S15D，S78D，S82D)或抗磷酸化(S15A，S78A，S82A)突變，在Ser15，Ser78和Ser82位點。在A549細胞中，低水平的p-p38細胞，但是高水平的干蛋白，磷化Hsp27-s78d/S82D(Hsp27-dbld)和Hsp27-S82D/S82D(Hsp27-S82D)，以及更少的野生型Hsp27和Hsp27-s15d，降低了SOX2、Oct4、Nanog、Klf4和C-myc。相比之下，A549細胞中表達結構活化形式MKK3E，激活了p38，導致了乾性蛋白的表達減少，而抗磷酸的hsp27-s78a/S82A(hsp27-dbla)和hsp27-s78a/s78a/S82A(hsp27-tria)增加了這些幹細胞的表達。與Hsp27突變對幹細胞蛋白表達的影響相一致，Hsp27-dbld和-TriD降低了A549細胞中側群的百分比，而Hsp27-dbla和-TriA增加了A549-mkk3e細胞的側群的百分比。這些數據表明，Hsp27的p38誘導磷酸化，特別是在Ser78和Ser82中，增強了Hsp27的能力，降低了幹細胞蛋白的表達，抑制了NSCLC細胞的乾性。

由於Hsp27涉及蛋白酶複合物，我們進一步研究了這些Hsp27突變對幹細胞的穩定性的影響。實際上，在A549細胞中磷化Hsp27突變(Hsp27-trid)，以及較少的野生型Hsp27，降低SOX2、Oct4、Nanog、Klf4和c-myc蛋白質半衰期，而抗磷酸化的Hsp27突變(Hsp27-tria)增加了A549- MKK3E細胞的這些幹細胞的半衰期。因此，Hsp27促進了干蛋白的降解，其方式依賴於在Ser78和Ser82上的p38/mk2介導的磷酸化。磷化Hsp27突變體顯示出增強幹細胞蛋白降解能力，而Hsp27的抗磷酸化突變則在激活p38的細胞中顯性逆轉這些蛋白質的降解。

結果表明，Hsp27直接結合介導蛋白降解的蛋白。因此，我們通過免疫反應-西方印跡分析研究了Hsp27是否直接與干蛋白質相互作用。Hsp27來自A549表達野生型Hsp27細胞(A549-Hsp27-wt)或磷化Hsp27(A549 bp-Hsp27-trid)或參照A549細胞(A549-mcs)所產生的免疫沉澱，而在免疫沉澱蛋白中發現的幹細胞的存在。結果表明,SOX2 Oct4、Nanog，Klf4和原癌基因c-Myc確實結合到野生Hsp27，幹細胞蛋白和Hsp27之間的相互作用被MK2型磷酸化位點的磷酸化突變進一步加強，,儘管幹細胞蛋白的總水平是減少在HSP27-TriD細胞與HSP27-WT相比。我們還在A549-MKK3E細胞中進行了IP實驗，該細胞表達HSP27-wt或HSP27-tria，數據顯示，儘管在HSP27-tria細胞中，幹細胞的總水平有所增加，但與HSP27-wt細胞相比，它們結合Hsp27減少。

總之，這些發現表明p38通過誘導MK2介導Hsp27 Ser78和Ser8位點的磷酸化抑制NSCLC細胞的幹細胞屬性，從而增強了Hsp27與干蛋白的結合，促進了這些幹細胞的蛋白酶的降解。

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