你要的細胞凋亡檢測方法都在這了

細胞凋亡檢測可以：

用於腫瘤細胞和組織在內的不同種類病理標本研究；

應用於臨床診療，新葯研製、生物製品開發、腫瘤放化療、以及從促凋亡角度探索腫瘤的基因治療；

對相關疾病的早期發現、放化療的療效評價具有舉足輕重的地位。

細胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹 7 種常用的測定方法。

1

形態學檢測法

實驗方法原理

根據凋亡細胞固有的形態特徵，使用合適的顯微鏡檢測凋亡細胞形態變化。

光學顯微鏡和倒置顯微鏡

（1）未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。

（2）染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。

熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。

常用的 DNA 特異性染料有：HO 33342 （Hoechst 33342），HO 33258 （Hoechst 33258），DAPI。三種種染料與 DNA 的結合是非嵌入式的，主要結合在 DNA 的 A-T 鹼基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。

Hoechst 是與 DNA 特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成 1 mg/ml 的濃度，使用時用 PBS 稀釋，終濃度為 10 ug/ml。

DAPI 為半通透性，用於常規固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成 1 mg/ml 的濃度，使用終濃度一般為 10 ug/ml。

結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa 期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb 期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體 （圖 1）。

透射電子顯微鏡觀察

結果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象（cavitations）的空泡結構 （圖 2）；Ⅱa 期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。

2

磷脂醯絲氨酸外翻分析（Annexin-V）法態學

磷脂醯絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位於細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS 可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中 （圖 3）。Annexin-V 是一種分子量為 35～36 KD 的 Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與 PS 高親和力特異性結合。將 Annexin-V 進行熒光素（FITC、PE）或 biotin 標記，以標記了的 Annexin-V 作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

碘化丙啶 （propidine iodide,PI） 是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI 能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將 Annexin-V 與 PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

實驗步驟

懸浮細胞的染色

將正常培養和誘導凋亡的懸浮細胞（0.5～1×106）用 PBS 洗 2 次，加入 100 ul Binding Buffer 和 FITC 標記的 Annexin-V（20 ug/ml）10 ul，室溫避光 30 min，再加入 PI（50 ug/ml）5 ul，避光反應 5 min 後，加入 400 ul Binding Buffer，立即用 FACScan 進行流式細胞術定量檢測（一般不超過 1 h）， 同時以不加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作為陰性對照。

貼壁培養的細胞染色

先用 0.25% 的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細胞。

爬片細胞染色

同上，最後用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。

結果

注意事項

整個操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞。

操作時注意避光，反應完畢後儘快在一小時內檢測。

除了上述方法，其他常見方法

熒光探針雙標記法

DNA ladder 法

Annexin V/PI 雙染色法

TUNEL 法

Caspase-3 活性檢測法

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