基於RNA探針捕獲DNA雙鏈體，鑒定超低頻率突變

解放軍306醫院，病理科，轉

現今，下一代測序（NGS）已經在生物醫學研究中得到廣泛應用，對眾多患者產生了深遠的影響。利用NGS技術，研究人員可以確定高覆蓋度和準確度的致病序列變異體。目前，罕見序列變異在生物醫學研究中引起越來越多的關注。到目前為止，在基於NGS的基礎研究中，大多數關鍵的致病變體已確認與某些重要疾病具有相關性，只有更深入地揭示罕見序列變異，才能對疾病的發病原因和進展進行詳細研究。此外，在基於NGS的臨床應用中，研究人員或醫生經常必須處理許多棘手問題，如患病樣品可能是高度異質的，這使得實際上以非常低等位基因存在的部分致病變體成為了稀有突變。因此，許多NGS技術的臨床應用需要檢測超低頻率的突變。

近日，Scientific Reports雜誌發表了一種新型NGS流程，可從數字化條形碼加密單鏈文庫的測序系統中捕獲RNA探針靶向的DNA雙鏈體，進而鑒定超低頻率突變。

該方法被研究人員稱為「DEEPER-Seq」，此方法使用RNA探針靶向兩條DNA鏈，將超靈敏單鏈庫構建與條碼糾錯相結合。DEEPER-Seq可以從少於20pg的PCR中產生具有PCR錯誤校正功能的NGS文庫，並同時靶向兩條DNA鏈，覆蓋率超過98.6％，並能以平均29.2％的比例捕獲靶序列。

研究人員在論文中表示，該方法在生物醫學和臨床應用中對發現新型低頻致病變體具有很大的潛力，並且可以為患者確定更多可行的治療靶點。通過揭示完整的患者基因組譜，包括高頻、中頻、低頻，特別是超低頻突變，該方法可以實現前所未有的個性化精準醫學水平。研究人員還表示，該方法也可以用於其他臨床應用，如血液樣本中循環DNA的測序等，在諸多方面具有巨大潛力。

DEEPER-Library流程

另一方面，單鏈文庫構建在本質上比標準雙鏈文庫構建的工作流程更加精確，並且已經被開發用於NGS分析。它將每個DNA單鏈分子作為文庫建設的基本單位，但在該研究之前，還沒有單鏈文庫流程能夠在單鏈DNA水平上併入條形碼，因此尚未實現糾錯。

與傳統的雙鏈體測序不同，對於有損傷或非常低量的DNA材料，將DNA單鏈作為單個分子進行處理並構建NGS文庫有著重要意義。在這一技術水平上，每個單鏈DNA分子可以來自完整的DNA雙鏈體分子，或者單鏈缺失的DNA雙鏈體分子，甚至一些有輕度損傷的DNA雙鏈體分子。此外，在任何終點修復之前，用唯一的條形碼標記每個單鏈DNA分子，可以消除在末端修復步驟期間人為錯誤引入DNA序列的任何可能性。這些改進可以促進兩個DNA鏈的高效測序，並獨立於其他樣品，且能通過每條鏈上的個體條形碼實現極端的糾錯能力，同時可以在數據分析中調用具有不同條形碼的互補DNA序列，從而進行完美匹配，以進一步確定真實突變。

參考資料：

Targeted sequencing of both DNA strands barcoded and captured individually by RNA probes to identify genome-wide ultra-rare mutations

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