PNAS報道前列腺癌相關的RNA拼接因子參與調控circRNA形成

6月13日，PNAS雜誌在線發表了一篇前列腺癌中篩選RNA拼接因子的文章，介紹基於CRISPR基因打靶文庫篩選體系，鑒定到與前列腺癌有關的RNA拼接因子HNRNPL，該因子也參與調控了circRNA的形成過程[1]。文章的通訊作者為東北大學生命科學與健康學院「青年千人計劃」費騰教授，哈佛大學公共健康學院/Dana-Farber癌症研究所X. Shirley Liu教授和Dana-Farber癌症研究所/哈佛大學醫學院Myles Brown教授[1]。

本文作者利用CRISPR的全基因組打靶文庫篩選與前列腺癌有關的基因，聚類分析後找出了其中與RNA編輯有關的基因，其中HNRNPL是影響最為顯著的。接下來作者分析了HNRNPL結合RNA的序列特異性，並基於RIP-Seq分析了該基因在前列腺癌細胞中調控RNA可變剪切和circRNA形成的作用[1]。

如何發現HNRNPL的？

本文主要是基於CRISPR打靶文庫篩選前列腺癌生長相關的基因，鑒定到的基因再根據通路和聚類分析，找出其中的RNA結合蛋白以及RNA拼接相關的調控因子，這其中發現了HNRNPL基因。那麼作者是如何通過CRISPR打靶文庫篩選相關基因的呢？

首先在LNCaP前列腺癌細胞中利用GeCKO v2慢病毒gRNA文庫進行感染。該文庫共含有123411條gRNA，對應於19050個基因，平均每個基因有6條gRNA對應。經過嘌呤黴素篩選三天後的細胞收集，取一半作為Day 0對照，另一半繼續培養14天，分別收取兩個時間點的總DNA，進行sgRNA測序，比較培養前後sgRNA變化情況。14天後明顯減少的sgRNA稱為陰性變化， 14天後明顯增多的sgRNA稱為陽性變化。陰性變化對應的基因為細胞增殖相關的關鍵基因，是本文下一步分析的候選基因。而陽性變化的則是細胞增殖抑制基因。

圖1 CRISPR打靶文庫篩選前列腺癌關鍵基因的技術路線（來自[1]）

作者首先收集了變化最明顯的前1000個陰性基因，與已報道的其他10種細胞中的關鍵基因進行比較，其中有三分之一的基因是共有的，其餘的大部分是LNCaP細胞特有的或者僅有少數幾種細胞中出現的關鍵基因。

圖2 LNCaP細胞特有的關鍵基因（來自[1]）

大部分共有的關鍵基因主要與蛋白生成，核糖核蛋白，核糖體，蛋白酶體系統及細胞周期等有關。LNCaP細胞特有的關鍵基因則包括AR（雄激素受體）和PI3K通路，也包括已知的前列腺癌有關的重要基因，包括STAT3、PIAS1、PIK3C2A、AR和MYC等基因。針對這些LNCaP細胞特有的關鍵基因的通路分析會發現其中包含了與RNA剪切及核糖核蛋白等通路。

圖3 LNCaP細胞特有的關鍵基因通路分析（來自[1]）

HNRNPL是 LNCaP細胞特有的生長關鍵基因之一

為找出前列腺癌有關的RNA結合蛋白或剪切相關蛋白，作者進行聚類分析後，發現HNRNP家族的多個基因出現在列表中，包括HNRNPL、HNRNPC和FUS基因，其中HNRNPL是影響最顯著的基因。

為驗證該結果，作者設計了RNA干擾試驗，針對所有HNRNP家族基因進行RNA干擾，看其對細胞增殖的影響，每個基因設計兩條siRNA。結果表明HNRNPL和HNRNPK的影響最顯著。作者又額外針對這兩個基因分別設計了另外兩條siRNA，以減少脫靶效應的可能影響，同時也將實驗的細胞類型擴大到去勢耐性細胞（castration-resistant）CWR22RV1，AR陰性細胞DU145和PC3，肺腫瘤的前列腺上皮細胞RWPE-1。結果表明HNRNPK可以抑制上述所有細胞的增殖活動，而HNRNPL僅對前列腺癌細胞有抑制增殖的作用，對健康前列腺上皮細胞沒有影響。因此，作者認為HNRNPL是前列腺癌特異性的基因。

圖4 HNRNP家族基因干擾後對前列腺癌細胞增殖的影響（來自[1]）

HNRNPL結合RNA特性分析

作為一種RNA結合蛋白，如何結合RNA是研究其功能的關鍵。作者採用RIP-Seq的方法進行分析。概括而言，就是利用甲醛交聯法將內源的蛋白與RNA交聯後進行IP，然後分離釣取到的RNA進行測序，最後找出結合位點的共性特徵。作者在本項工作中共分析到了分布在1549個基因上的6892個結合位點。基因組定位分析表明絕大部分位點位於內含子和3』UTR區。HNRNPL的結合位點為CA重複/富集序列，與之前在其他細胞中的結果相一致。

圖5 RIP-Seq分析HNRNPL的結合位點特徵（來自[1]）

為避免單一抗體帶來的偏差（抗體結合可能影響RNA結合特性），作者用了兩種不同的單克隆抗體進行RIP-qPCR驗證，結果表明雖然結合能力有所差別，但都能很好的重現結果，說明所進行的RIP-Seq實驗結果比較穩定可靠。作者還利用結合位點的RNA設計的探針進行RNA Pull-down實驗，驗證了HNRNPL結合RNA為鏈特異性的。

圖6 HNRNPL結合位點驗證（來自[1]）

在前列腺癌細胞中HNRNPL調控RNA的可變剪切

HNRNPL傾向於結合內含子的特性意味著它在RNA剪切過程中發揮重要作用。於是作者首先基於RNA干擾試驗，分析了HNRNPL相關的mRNA可變剪切形式。在Poly(A)+測序的結果中發現了206種mRNA的可變剪切，以跳躍外顯子的可變剪切（SE）為主。有趣的是作者發現了其中包括AR基因的可變剪切。干擾HNRNPL後明顯促進外顯子2b進入成熟的mRNA但減少外顯子2與3直接拼接的mRNA分子形式，前體RNA分子變化並不明顯。

圖7 HNRNPL調控RNA的可變剪切（來自[1]）

HNRNPL影響circRNA生成

circRNA也可以視為RNA可變剪切的一種形式，自然需要討論HNRNPL對circRNA的影響情況。HNRNPL基因干擾後通過RNase R消化測序，共找到了139種明顯上調和93種明顯下調的circRNA。這些上調的circRNA對應於較強的HNRNPL結合力。

圖8 HNRNPL對circRNA的影響（來自[1]）

同一個基因往往伴隨著多種circRNA分子形式。以PPFIA2基因為例，RNA Pull-down實驗和測序實驗均證實了HNRNPL參與circRNA的形成。

圖9 HNRNPL調控circRNA的形成（來自[1]）

為進一步驗證HNRNPL參與調控circRNA的形成過程，作者構建了一個細胞內circRNA形成的報告系統，用GAPDH基因的5和6號外顯子和相關的內含子序列在特定位置分別插入20×的CA重複元件(CA)20，然後基於定量PCR看HNRNPL對circRNA的形成影響。結果表明HNRNPL的確參與調控了circRNA的形成。

圖10 報告系統驗證HNRNPL調控circRNA的形成（來自[1]）

HNRNPL與前列腺癌疾病相關性分析

作者最後分析了HNRNPL與前列腺癌的疾病相關性，表達譜分析和免疫組化分析均表明前列腺癌中HNRNPL表達增高。組學數據分析後表明，HNRNPL相關的可變剪切和circRNA均為前列腺癌相關的過表達基因。

圖11 HNRNPL與前列腺癌疾病相關性（來自[1]）

本文雖然不是專門研究circRNA的，但所發現的前列腺癌相關的RNA剪接作用調控蛋白HNRNPL是疾病特異性circRNA形成的重要原因，為解釋疾病相關的circRNA變化提供了有價值的參考，也豐富了我們對circRNA形成機制的認識。

參考文獻：

1. Fei, T., et al., Genome-wide CRISPR screen identifies HNRNPL as a prostate cancer dependency regulating RNA splicing. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017.

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