circRNA通過誘導c-Myc入核促進腫瘤發生

知識 06-28

6月16日，Nature子刊 Cell Death & Differentiation在線發表了加拿大多倫多大學楊柏華教授為通訊作者的文章，介紹發現了circRNA circ-Amotl1通過誘導c-Myc入核而促進腫瘤發生[1]。就在前不久，楊教授剛剛發表了文章介紹該circRNA在創口癒合過程中發揮重要作用[2]。

文中作者圍繞circRNA circ-Amotl1在腫瘤中的作用機制展開了相關探索研究，發現circ-Amotl1能夠通過誘導c-Myc入核促進腫瘤生成[1]。

circ-Amotl1在腫瘤細胞中的作用

circ-Amotl1由位於11號染色體的Amotl1基因的第三外顯子形成。在乳腺癌標本中， circ-Amotl1的表達量明顯高於癌旁組織。一些常見的腫瘤細胞系也表現出了circ-Amotl1高表達的特性。有趣的是，作者發現在細胞處於長滿培養皿的狀態後，circ-Amotl1的表達會降低，這也暗示著circ-Amotl1與細胞增殖有關。

圖1 circ-Amotl1在腫瘤中高表達，與腫瘤細胞增殖有關（來自[1]，排列方式有改動）

分別設計針對circ-Amotl1和線性Amotl1的mRNA的siRNA，表明干擾circ-Amotl1明顯抑制細胞增殖並促進細胞凋亡。

圖 2 干擾circ-Amotl1後抑制細胞增殖並促進細胞凋亡（來自[1]，排列方式有改動）

過表達circ-Amotl1促進細胞增殖

作者構建了過表達circ-Amotl1的載體，實驗驗證後表明過表達circ-Amotl1並不顯著影響內源性Amotl1基因mRNA的RNA水平和翻譯水平，也不影響Amotl1蛋白的相互作用分子狀態。但過表達circ-Amotl1能顯著提高細胞增殖能力，抵抗血清飢餓和細胞凋亡。

圖3 過表達circ-Amotl1促進細胞增殖（來自[1]）

circ-Amotl1對腫瘤裸鼠模型的影響

分別在MDA-MB-231 或HepG2細胞構建的裸鼠皮下腫瘤模型中，過表達circ-Amotl1明顯促進腫瘤增殖，腫瘤組織的體積明顯增加。單細胞克隆生成實驗也表明過表達circ-Amotl1明顯促進腫瘤克隆生成速度，比對照組快了近30倍。過表達circ-Amotl1後細胞倍增時間縮短至15-18h，明顯高於對照細胞。

圖4 過表達circ-Amotl1促進腫瘤生成（來自[1]）

circ-Amotl1與c-Myc相互作用

為弄清楚過表達circ-Amotl1促進細胞增殖和腫瘤形成的機制，作者利用常見的促進細胞增殖的基因的抗體進行RIP實驗，看哪種蛋白結合circ-Amotl1的能力最強。結果表明c-Myc、EGF、c-Myb、NF1和AKT的抗體能夠明顯的釣取到circ-Amotl1分子，其中c-Myc是作用最強的。作者也反覆驗證了c-Myc與circ-Amotl1的相互作用情況，特異性靶向circ-Amotl1的環化位點的探針也可以直接釣取到c-Myc蛋白，說明circ-Amotl1與c-Myc 的相互作用是客觀穩定的。

圖5 circ-Amotl1與c-Myc 相互作用（來自[1]）

circ-Amotl1促進c-Myc的功能

c-Myc是重要的轉錄因子，作者接下來分析了常見的受c-Myc 調控的基因在過表達circ-Amotl1後的表達狀態，結果表明過表達circ-Amotl1能明顯促進下游基因的表達。circ-Amotl1促進c-Myc 結合下游基因啟動子的能力。在c-Myc陰性的HO15.19細胞中過表達circ-Amotl1不會促進細胞增殖，干擾circ-Amotl1後c-Myc下游基因的表達同步下降。

圖6 circ-Amotl1促進-Myc調控的下游基因的表達（來自[1]）

分離亞細胞組分後鑒定結果表明circ-Amotl1和c-Myc均主要定位於細胞核內，而干擾circ-Amotl1後c-Myc定位於核內的比例明顯減少。交聯實驗也證實了circ-Amotl1與c-Myc相互作用共定位的關係。原位雜交+免疫熒光實驗也證明circ-Amotl1與c-Myc共定位在細胞核中。

圖7 circ-Amotl1與c-Myc在細胞核中共定位（來自[1]）

circ-Amotl1與c-Myc相互作用

通過計算機模擬，作者模擬了circ-Amotl1與c-Myc相互作用的3D模型圖。並通過不同的軟體預測了兩者相互作用的氨基酸和鹼基對應關係。然後利用RNA pull-down和RIP等實驗證實了預測的相互作用位點。最後在小鼠模型中驗證了所設計的突變分子失去了促進腫瘤生成的作用。

圖8 circ-Amotl1與c-Myc相互作用位點分析（來自[1]）

本文首次發現circRNA通過促進c-Myc入核，促進其發揮功能，為circRNA功能研究提供了新思路。

參考文獻：

1. Yang, Q., et al., A circular RNA promotes tumorigenesis by inducing c-myc nuclear translocation. Cell Death Differ, 2017.

2. Zhen-Guo Yang, F.M.A., William W Du, Yan Zeng, Juanjuan Lyu, De Wu, Shaan Gupta, Weining Yang and Burton B Yang, The circular RNA circ-Amotl1 interacts with STAT3 increasing its nuclear translocation and wound repair by modulating Dnmt3a and miR-17 function. Molecular Therapy, 2017.

文 | circRNA 吉賽生物

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