連環計：「垃圾」DNA成「環狀DNA」生成調控RNA！

導讀

2017年3月《Cell》期刊發表最新研究，來自瑞士伯爾尼大學的研究人員描述了一種發生在第四雙小核草履蟲（Paramecium tetraurelia）的單細胞纖毛蟲的獨特機制：「垃圾」DNA連接成為環狀DNA，環狀DNA被轉錄形成調控RNA，調控的雙鏈RNA又能夠編輯互補的DNA，從而形成正反饋調控環路。

環狀DNA簡介

環狀DNA有兩種：環狀單鏈DNA和環狀雙鏈DNA，它們一般存在於病毒、細菌和真核生物的線粒體和葉綠體中。環狀DNA一般比線性DNA結合更緊密更穩定，儲存的遺傳信息更多（比如，重複序列）。原核生物的擬核是大型環狀DNA。

a.葉綠體DNA

葉綠體DNA（chloropast DNA，cpDNA），存在於葉綠體內的DNA。高等植物葉綠體的DNA為雙鏈共價閉合環狀分子，其長度隨生物種類而不同，一般為45微米；通常一個葉綠體含有10~50個DNA分子。

b、線粒體DNA（人類線粒體DNA）

線粒體中的遺傳物質，線粒體能為細胞產生能量(ATP)，是在細胞線粒體內發現的脫氧核糖核酸特殊形態。與核基因組相比，線粒體基因組有如下性質：所有的基因都位於一個單一的環狀DNA分子上。遺傳物質不為核膜所包被。DNA不為蛋白質所壓縮。基因組沒有包含那麼多非編碼區域（調控區域或「內含子」）。線粒體DNA比DNA存活時間長得多，而且遺傳自母親，因此用來確認家庭關係十分理想。

c、細菌染色體（chromosome of bacteria）

細菌染色體由一條雙股環狀DNA分子組成，附著在橫隔中介體或細菌膜上。細菌染色體無組蛋白包繞。細菌染色體上的基因與真核細菌不同，無內含子，轉錄後形成的mRNA不必再剪切、拼接，可直接翻譯成多肽。細菌染色體DNA的複製，在大腸桿菌已被證明是雙向複製。

d、共價、閉合、環狀DNA分子（covalently closed circularDNA，cccDNA）

在乙肝病毒的複製過程中，病毒DNA進入宿主細胞核，在DNA聚合酶的作用下，兩條鏈的缺口均被補齊，形成超螺旋的共價、閉合、環狀DNA分子（covalently closed circularDNA，cccDNA）。細胞外乙型肝炎病毒DNA是一種鬆弛環狀的雙鏈DNA（relaxed circularDNA，rcDNA）分子。cccDNA是乙肝病毒前基因組RNA複製的原始模板，雖然其含量較少，每個肝細胞內只有約5～50個拷貝，但對乙肝病毒的複製以及感染狀態的建立具有十分重要的意義，只有清除了細胞核內的cccDNA，才能徹底消除乙肝患者病毒攜帶狀態，是抗病毒治療的目標。

e、質粒DNA（plasmid DNA）

質粒存在於許多細菌以及酵母菌等生物中，是細胞染色體外能夠自主複製的很小的環狀DNA分子。

f、垃圾DNA（Junk DNA）來源的環狀RNA

轉座因子或轉座子是一類在很多後生動物中（包括線蟲、昆蟲和人）發現的可移動的遺傳因子。 一段DNA順序可以從原位上單獨複製或斷裂下來，環化後插入另一位點，並對其後的基因起調控作用，此過程稱轉座。這段序列稱跳躍基因或轉座子，可分插入序列（Is因子），轉座（Tn），轉座phage。

本文著重闡述類似轉座機制的元件，源於轉座子短鏈的內部剔除序列IESs（internal eliminated sequences，IESs）形成小切離DNA片段（excised DNA segment）轉錄為具有調節功能的小RNA。

《Cell》報道摘要

一種被稱作第四雙小核草履蟲（Paramecium tetraurelia）的單細胞纖毛蟲物種如何將小切離DNA片段（excised DNA segment）轉錄為具有調節功能的小RNA？

草履蟲找出一種方法將小切離DNA片段隨機地串聯在一起形成一條鏈，一旦這條鏈達到合適的長度（大約200個鹼基對），就將它的末端連接在一起形成這些小切離DNA片段的環形串聯體。這些環形串聯體經轉錄後產生雙鏈RNA。所產生的雙聯RNA在Dicer樣蛋白的切割下產生一群具有調節功能的小RNA，而且這些小RNA與小切離DNA片段在序列上準確地匹配。

模型假設

（1）短鏈RNA靶向發育的大核基因組DNA（macronuclear genomic DNA）為DNA切割做準備

（2）切割不同長度的DNA片段。 藍色：> 200 bp，其他顏色：

（3）Ligase IV連接酶對較長切割的DNA片段（藍色）環化，對較短片段（多色）進行連接後，再環化。

（4）雙向轉錄形成雙鏈RNA（dsRNA）。

（5）通過Dcl5(Dicer-like protein)蛋白酶切割長鏈dsRNA以產生iesRNA（internal eliminated sequences RNA，iesRNA)。

（6）在正反饋迴路中，iesRNA又靶向互補序列進行循環切割。

機制模型的體外重構

1.將模擬一個切離的IES（excised IES）的DNA注射細胞，發現切離的IES有效的促發iesRNA通路，最終導致正反饋調節DNA的切離。

A:IES切離模型：IES（紅色）在中間，非IES（藍色）在兩端，斷裂的雙鏈DNA 5』端4nt懸頭，懸頭中間為TA序列，斷裂兩端非IES序列粘性末端退火後重連。

B:圖中所示隱藏的IES（crypIES）DNA oligos具有 5』端4nt懸頭和3『端磷酸化，切離後測序驗證一個TA序列移去一個TA序列保留，預期符合。

C:Mating type RNA作為對照，它的不依賴Dcl5進行沉默;Cryptic IES DNA注射細胞，當Dcl5被沉默後，切離效率顯著降低。

D:當crypIESa有3『懸頭時候無法發生切離作用，只有當5『懸頭時候正常切離。

2.通過將切離的IESs進行連接生成iesRNA？

A:IES切離模型表明成功產生27mer雙鏈DNA分子，而RNA聚合酶會將如此短DNA模板進行轉錄嗎？顯然No！

B:通過將200多個iesRNA mapping發現環化DNA可以解釋轉錄問題。

C:通過將Cryptic IES DNA進行連接注射細胞，切離的確有效發生。

3.串聯的IESs成環並且能生產iesRNA

A:串聯IES形成DNA環

B:發育晚期的總RNA的RT-PCR檢測可以發現串聯體

C:擴增子引物序列對，不同顏色代表不同擴增大小片段。

4.連接酶（Ligase IV）是否是iesRNA生成所必須的？

為驗證連接酶（Ligase IV）是否是iesRNA生成所必須？作者對Ligase IVa和IVb進行基因沉默。沉默後的進行小RNA測序發現：

A:匹配的IES顯著減少

B:iesRNA mapping>150nt 長IESs顯著升高

C:maping 31-120bp/1-30bp的比率顯著增加

綜上所述，所有試驗證據支持作者的假設！

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