一篇文章看懂:miRcroRNA轉染流程
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細胞轉染是指將外源分子如DNA,RNA等導入真核細胞的技術。常規轉染技術可分為瞬時轉染和穩定轉染(永久轉染)兩大類。本實驗室主要是質粒轉染、miRcroRNA轉染、慢病毒轉染、藥物轉染、多肽轉染等。
一. 實驗材料及試劑
六孔板、CO2培養箱、EP管、酒精燈等;無血清培養基、MEM-α或DMEM、RNA、lipofectamine 2000、MSC細胞等。
二、實驗內容
1、當六孔板中MSC細胞密度達90%時,準備轉染,將無血清培養基、MEM-α或DMEM取出復溫並注意平衡好;
2、取出細胞,將培養基換成無血清培養基,放回孵箱培養;
3、取滅菌的EP管,按要求混好RNA(約100pmol/孔),每管250ul DMEM,混勻;
4、另取EP管,加入lipofectamine 2000(5 ul/孔)和MEM-α或DMEM(250ul/孔),輕輕混勻後室溫靜置5min;
5、將上述兩個EP管混勻;
6、室溫靜置20min,將lipofectamine 2000-質粒混合液滴到六孔板中,500ul/孔;
7、將細胞放回孵箱培養,4h後換回含血清的完全培養基。
三、注意事項
1、轉染的時候培養基中不能添加抗生素。抗生素,比如青黴素和鏈黴素,一般對於真核細胞無毒,但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性,使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導致轉染效率低。所以,在轉染培養基中不能使用抗生素。
2、如果在無血清條件下轉染,使用含血清的正常生長培養基進行細胞鋪板。在加入複合物前移去生長培養基,替換為0.5mL無血清培養基。
3、在37℃,5%的CO2中保溫24-48小時,無須去掉複合物或更換培養基或者在4-5小時後更換生長培養基也不會降低轉染活性。
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